Panton-Valentine杀白细胞素原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的原核表达金黄色葡萄球菌Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)蛋白,并进行生物学活性鉴定。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌DNA,利用PCR扩增LukF-PV和LukS-PV编码基因,亚克隆入表达载体pET28 a,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21株,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后获得可溶性的蛋白,Western blot对其鉴定。并以人多形核粒细胞(PMNs)为靶细胞检测其生物学活性。结果成功构建了LukF-PV和LukS-PV基因的表达载体,经IPTG诱导和亲和层析纯化法获得重组蛋白,Western blot鉴定证实其为重组PVL蛋白。实验表明该蛋白具有诱导人多形核粒细胞(PMNs)凋亡的作用。结论成功地表达获得了具有生物学活性的PVL重组蛋白,为PVL快速检测方法的建立和致病机制研究奠定基础。

Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定

目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a(+)表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a(+)重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。

杀白细胞素pvl基因阴性MRSA对抗菌药物的耐药性研究

目的研究杀白细胞素(PVL)pvl基因阴性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对多种抗菌药物的耐药性。方法采用头孢西丁纸片扩散法检测MRSA;用聚合酶链反应(PCR)检测m ecA基因及pvl基因;采用琼脂稀释法测定金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度(M IC)并检测pvl基因阴性MRSA对12种抗菌药物的耐药性。结果 71株金黄色葡萄球菌中检测出33株pvl基因阴性MRSA,检出率为46.4%(33/71);对青霉素类抗菌药物的耐药率为100.0%;对其他类抗菌药物呈多重耐药并以ECLOTGMP为主要耐药模式,占66.7%(22/33);未发现对达托霉素、替考拉宁和万古霉素耐药的菌株。结论医院感染中以pvl基因阴性MRSA为主,并呈现多重耐药;pvl基因阴性MRSA主要耐药模式为对红霉素、环丙沙星、克林霉素、苯唑西林、四环素、庆大霉素、复方磺胺甲口恶唑和青霉素耐药,是主要流行株,要谨慎使用以上8种抗菌药物。

金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药特点及其Panton-Valentine杀白细胞素基因的携带状况分析

目的分析金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药性特点及其Panton-Valentine杀白细胞素基因的携带状况。方法回顾性调查了温州医学院第一附属医院2005年1月至2006年1月医院感染的金黄色葡萄球菌所致肺部感染患者132例,对其体外药敏试验进行分析;并利用多重PCR检测其PVL基因,应用多位点基因序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对PVL基因阳性的菌株进行序列分型。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的SCCmec基因分型采用多重聚合酶链反应。结果致肺部感染的132株金黄色葡萄球菌的耐药现象较为严重,仅对万古霉素、呋喃妥因及复方新诺明等药物的敏感率较高;其中经多重PCR筛选出10株携带PVL基因的金葡菌,全部为MRSA菌株,3株为ST239-SCCⅢ,2株为ST398-SCCmecⅢ,2株为ST398-SCCmecⅣ,ST25-SCCmecⅢ、ST59-SCCmecⅠ和ST88-SCCmecⅢ各1株。结论肺部感染的金黄色葡萄球菌对多种抗生素耐药,呈多重耐药性;其携带PVL基因占一定比例。

国内杀白细胞素阳性金黄色葡萄球菌感染的研究现状

金黄色葡萄球菌是临床引起感染性疾病最常见的病原菌之一，它的致病性与其携带的多种毒素因子有关。携带毒素因子的金黄色葡萄球菌毒力更强，与感染后疾病的严重程度呈正相关，产毒素菌株所造成的感染重、病程长，加大治疗难度和护理难度，同时增加了患者的痛苦和经济负担。杀白细胞素（PVL）是金黄色葡萄球菌产生的一种重要外毒素，

杀白细胞素基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性分析

目的了解杀白细胞素(PVL)基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药情况,指导临床合理用药。方法对临床收集的47株PVL基因阳性MRSA采用PCR法检测PVL基因,采用纸片扩散法进行药敏试验,并对结果进行分析。结果 47株MRSA的PVL基因检出率为46.8%,PVL基因阳性、阴性MRSA对β-内酰胺类抗菌剂均100.0%耐药,PVL基因阳性MRSA对氨基糖苷类、利福平、四环素、红霉素、环丙沙星、亚胺硫霉素等抗菌剂全部耐药,对盐酸克林霉素的耐药率为95.5%;PVL基因阴性MRSA对上述抗菌剂的耐药性虽比PVL基因阳性MRSA轻,但耐药率也在88.0%以上,2组间耐药性比较,差异有统计学意义(P<0.05)。对复方新诺明敏感率在90.0%以上,未发现对万古霉素耐药株。结论 PVL基因阳性MRSA在临床检出率已较高,耐药性严重并呈多重耐药特征,增加了临床抗感染治疗的难度。

金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素对THP-1巨噬细胞活性及凋亡/坏死的作用

目的探讨金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素(PVL)对THP-1巨噬细胞活性及凋亡/坏死的作用。方法采用CCK-8比色法检测重组PV-杀白细胞素(rPVL)对THP-1巨噬细胞活性的影响;应用流式细胞仪检测THP-1巨噬细胞凋亡/坏死率;用Western blot法检测rPVL刺激THP-1巨噬细胞NF-κB的蛋白表达。结果随着rPVL对THP-1巨噬细胞作用的浓度和时间的增加,细胞活性进行性下降,在低浓度(5 nmol/L rPVL)以凋亡为主,在高浓度(40 nmol/L rPVL)以坏死为主,且具有时间依赖性。NF-κB的蛋白在高浓度(40 nmol/L rPVL)刺激下活化,2 h量表达最大,具有时间依赖性。结论 rPVL对THP-1细胞有毒性作用,低浓度诱导其凋亡、高浓度促进坏死,并能活化NF-κB的蛋白。

金黄色葡萄球菌杀白细胞素的研究进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）普遍存在,是导致医院和社区感染的重要病原菌。MRSA最早出现在医院内呼吸道感染中,随着时间的推移,逐渐向院外扩散,社区相关性MRSA（communityassociated MRSA,CA-MRSA）成为院外感染的重要病原菌。有研究者发现,几乎所有CA-MRSA存在杀白细胞素（pantonvalentine leucocidin,PVL）[1-4]。

表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1单核细胞自噬和凋亡

目的研究表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1细胞自噬和凋亡机制。方法在大肠杆菌中表达重组杀白细胞素(rPVL),并免疫家兔制备多克隆抗血清。采用反转录PCR和Western blot法鉴定表达PVL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。分别使用表达PVL的MRSA(MRSA^(PVL+))和不表达PVL的MRSA(MRSA^(PVL-))感染THP-1细胞,于感染后1、3、6 h收集细胞,采用实时定量PCR检测自噬相关基因3(ATG3)、ATG4B、ATG5、ATG7、ATG12;Western blot法检测beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、caspase-3的蛋白水平;二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针负载法检测细胞活性氧(ROS)水平;异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功制备PVL多克隆抗体,鉴定出1株MRSA^(PVL-)菌和1株MRSA^(PVL+)菌。分别以两株菌与THP-1细胞共培养1 h,MRSA^(PVL+)组仅ATG7表达量显著高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组;共培养3 h,MRSA^(PVL+)组ATG7和ATG12表达量高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组,其他基因表达量变化不明显。感染1、3、6 h,MRSA^(PVL+)感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于MRSA^(PVL-)感染组和正常对照组;感染1 h和3 h,MRSA^(PVL-)感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组;感染6 h,MRSA^(PVL-)菌感染组细胞mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组。感染1、3、6 h,MRSA^(PVL+)组细胞ROS水平和凋亡率均高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组,且随着感染时间的延长细胞ROS水平和凋亡率持续增加;MRSA^(PVL-)组细胞ROS水平和凋亡率也高于正常对照组。结论MRSA^(PVL+)对THP-1细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制作用更强,可促进ATG12/ATG7/ATG5自噬通路活化增加THP-1细胞自噬;同时,MRSA^(PVL+)诱导THP-1细胞ROS产生增加,促进细胞凋亡。

产杀白细胞素金黄色葡萄球菌感染的研究现状

国外多数回顾性研究发现产杀白细胞素(PVL)金黄色葡萄球菌感染有着特有的临床表现,特别是产PVL金黄色葡萄球菌相关性坏死性肺炎可能为一新现的临床疾病,由此PVL在金黄色葡萄球菌感染中的致病研究日益受到重视。本文就目前对产PVL金黄色葡萄球菌感染的致病机制、流行病学、检测和防治等问题研究作一综述。

74例金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因检测

杀白细胞素（panton-valentine leukocidin,PVL）是金黄色葡萄球菌的一种重要致病因子,可以引起毛细血管扩张、趋化效应、多形核白细胞渗出、核破裂、皮肤坏死等[1]。本文采用PCR法对临床分离的金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因进行检测,旨在探讨PVL的表达与临床感染的相关性。

重组PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体并鉴定。方法纯化获得重组蛋白LukF-PV,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA法测定抗体滴度,Western blotting法鉴定免疫活性。结果成功免疫新西兰白兔获得多抗血清,ELISA测定其效价为1∶103,Western blotting鉴定其能识别重组蛋白和金葡菌PVL蛋白。结论成功制备出重组金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体,并进行鉴定,为建立产杀白细胞素的金黄色葡萄球菌的快速、廉价的免疫学检测方法奠定基础。

PV-杀白细胞素和PDTC对THP-1巨噬细胞IL-1β表达的影响

目的探讨NF-κB信号通路在金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞毒素相关性肺损伤中的作用。方法实验前用100 nmol·L-1佛波酯孵育THP-1细胞48 h,充分诱导使其分化为巨噬细胞,分为三组,正常对照组、PDTC阻断组和rPVL刺激组,PDTC阻断组实验前1 h加入PDTC孵育,1 h后分别加入PBS和rPVL刺激其诱导分化好的巨噬细胞,采用ELISA检测细胞上清IL-1β的蛋白含量,RT-PCR检测IL-1βmRNA水平的表达,Western-blot检测NF-кB的表达。结果 PV-杀白细胞毒素能促进THP-1巨噬细胞分泌IL-1β,同时rPVL能活化NF-κB蛋白,NF-κB信号通路的特异性阻断剂能够抑制NF-κB蛋白的活化。结论 NF-κB信号通路蛋白激活及细胞因子大量释放可能是PVL相关肺损伤重要的发病机制。

亚抑菌浓度的抗生素对金黄色葡萄球菌杀白细胞素表达及释放的影响

目的：观察亚抑菌浓度抗生素对金黄色葡萄球菌（金葡菌）杀白细胞素（PVL）表达的影响。方法利用 PCR筛选出8株 PVL 阳性金葡菌。常量稀释法测定克林霉素、替加环素、利奈唑胺和万古霉素最低抑菌浓度值（MIC）；荧光定量 PCR 测定前3种抗生素对 PVL 阳性金葡菌在1/8、1/4、1/2 MIC 作用下 PVL mRNA 相对变化。 ELISA 法测定4种抗生素1/4、1/2 MIC 时 PVL 蛋白含量。结果克林霉素、利奈唑胺和替加环素在1/8、1/4、1/2 MIC 时均可降低 PVL表达。 PVL mRNA 在3种抗生素作用下分别降低17%～82%、8%～85%和11%～78%；PVL 蛋白水平在1/4、1/2 MIC 克林霉素和利奈唑胺作用下，分别下降了65%和83%、40%和61%，替加环素仅1/2 MIC 时降低较明显，达64%。万古霉素不影响 PVL 表达。结论不同抗生素亚抑菌浓度时对 PVL 表达影响不同。克林霉素和利奈唑胺可明显降低PVL 表达，且呈剂量依赖性，替加环素只在较高浓度时抑制PVL 表达，万古霉素对 PVL 表达无影响。

金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因敲除菌株的构建及生长特性分析

为构建金黄色葡萄球菌杀白细胞素(PVL)基因敲除的菌株,本研究以pBT2温敏型质粒为载体,构建金黄色葡萄球菌PVL基因敲除质粒pBT2-ΔPVL,并经酶切鉴定。将其转化至金黄色葡萄球菌RN4220中经其修饰后电转化至金黄色葡萄球菌ATCC 49775中,在30℃和42℃多次交替传代并经红霉素抗性筛选,构建PVL基因敲除菌株,经PCR和测序鉴定后命名为ΔPVL。以pLI50穿梭质粒为载体,构建金黄色葡萄球菌PVL基因回补质粒pLI50-PVL,按照同样方法将其转化至敲除菌株ΔPVL中,构建PVL基因回补菌株CΔPVL。将ΔPVL在TSB培养基中连续传代培养后,经PCR检测敲除菌株体外的遗传稳定性;分别绘制敲除菌株ΔPVL和回补菌株CΔPVL的生长曲线,检测其体外生长特性。结果显示,正确构建了两种质粒pBT2-ΔPVL、pLI50-PVL和两种菌株ΔPVL、CΔPVL。敲除菌株ΔPVL连续传代未发生回复突变,具有良好的遗传稳定性。生长特性结果显示敲除菌株生长速率显著低于野生菌株,表明PVL基因在金黄色葡萄球菌的生长调节中发挥着一定的作用。本研究为进一步研究金黄色葡萄球菌PVL的功能及致病机制奠定了基础。

影响金黄色葡萄球菌杀白细胞素ED转录表达的培养条件

为探讨影响金黄色葡萄球菌杀白细胞素ED(leukocidin ED,LukED)转录表达的最佳培养条件,采用定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测金黄色葡萄球菌Newman菌株lukE在TSB、BHI、YCP、MHB和LB培养基中不同生长阶段(对数生长早期、中期、晚期和平台期)的表达情况。以表达量较低的培养基为基础,分别加入表达量最高的培养基的不同成分,分析促进lukED表达的物质。结果显示,lukE mRNA水平在YCP培养基中生长至对数晚期时表达最高;YCP组分酵母浸出物、酪蛋白氨基酸及丙酮酸钠均能显著促进lukE转录表达,前两者效果更好。

金黄色葡萄球菌杀白细胞素ED的研究进展

杀白细胞素ED(leukocidin ED,LukED)是金黄色葡萄球菌产生的双组分成孔杀白细胞素之一,由共转录于一条mRNA的lukE和lukD两个基因编码。LukED可与趋化因子受体CCR5结合以杀伤巨噬细胞、T细胞和树突细胞,或与中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤(natural kiler,NK)细胞上的表面受体CXCR1/2结合以促进金黄色葡萄球菌的致病性及系统性感染宿主的死亡。此外,LukED还可结合Duffy抗原趋化因子受体,使裂解红细胞释放血红蛋白,促进细菌的铁吸收和生长繁殖。LukED的表达受双组分信号转导系统附属基因调节子——毒素抑制子(Agr-Rot)通路和转录调节子RpiRc、SpoVG的调控。lukED基因在金黄色葡萄球菌中广泛流行,与金黄色葡萄球菌所致血流感染、脓疱病及抗生素相关性腹泻密切相关。这些进展对了解LukED的表达调控机制、临床意义及其在细菌致病机制中的作用,开发新的金黄色葡萄球菌感染抗毒素治疗药物具有重要意义。

葡萄球菌杀白细胞素研究进展

近年来,国外对葡萄球菌杀白细胞素(SL)进行了大量的研究。鉴于国内尚无有关报告,本文就此研究简史,毒素的制备与纯化、理化性状与化学组成,生物学活性,细胞膜损害的分子机理及其致病性、免疫性、抗癌活性等研究动态作了简要的评述。最后对其研究意义与展望进行了概括性的提示。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因亚型的流行及MLST分子分型

目的探讨临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)杀白细胞素(pvl)基因亚型的流行及MLST分子分型特征。方法收集非重复MRSA 287株,按照美国疾病预防控制中心的社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)定义分为医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)和CA-MRSA两组。采用PCR方法扩增pvl基因,产物双向测序并分析核苷酸变异情况;pvl基因阳性(pvl^(+))菌株进行多位点序列(MLST)分型并采用eBURST软件进行克隆复合群(CC)分析。结果287株MRSA中,51株为pvl^(+)菌株(17.8%,51/287),其中29株为CA-MRSA(56.9%,29/51),22株为HA-MRSA(43.1%,22/51)。pvl^(+)菌株经双向测序共发现4个位点(527、663、1396和1729)存在核苷酸变异,根据527位点的差异分为H(H1和H2)和R(R1和R2)亚型。其中46株(90.2%,46/51)为H型(6株H1、40株H2),5株(9.8%,5/51)为R型(1株R1、4株R2)。H型主要属于CC59(ST59/ST388)(69.6%,32/46),其次为CC22(ST22)(10.9%,5/46),CC1(ST1/ST188)(6.5%,3/46)、CC88(ST88)(4.3%,2/46)、CC5(ST149)(4.3%,2/46)、CC9(ST9)(2.2%,1/46)和CC30(ST30)(2.2%,1/46);仅在CC59(ST59)、CC88(ST88)和CC5(ST25)型菌株中发现R型。CA株和HA株携带的pvl均以H亚型为主,分别占86.2%(25/29)和95.5%(21/22),两组差异无统计学意义。结论本地区临床分离MRSA携带的pvl以H亚型(H2)为主,主要克隆型别为CC59;CA-MRSA和HA-MRSA携带的pvl亚型没有明显差异。