基于SSR标记的西南地区野生带叶兜兰资源遗传多样性分析

带叶兜兰[Paphiopedilum hirsutissimum (Lindl.ex Hook.f.) Stein]具有较高的观赏价值,是中国珍稀濒危保护植物。为了研究中国西南地区野生带叶兜兰资源的遗传特性,促进野生带叶兜兰资源的保护和利用,本研究利用SSR分子标记技术对中国西南地区广西、云南、贵州3省(区)收集的6个居群190份带叶兜兰资源进行遗传多样性和群体遗传结构分析。结果表明:从115对引物中共筛选出10对扩增效果好的引物,10对SSR引物在190份带叶兜兰中共检测到50个等位基因,平均每个位点等位基因(N_(a))为5个,平均有效等位基因数(N_(e))为2.4835个;平均Shannon信息指数(I)为0.8592,平均观测杂合度(H_(o))为0.4518;平均期望杂合度(H_(e))为0.4387,平均Nei’s基因多样性指数(h)为0.4370,平均多态信息含量(PIC)为0.3996。6个野生带叶兜兰居群的N_(a)为2.8000~4.3000,N_(e)为1.9655~2.4060,H_(o)为0.3891~0.4839,H_(e)为0.3795~0.4683,Shannon信息指数(I)为0.6584~0.8369,Nei’s基因多样性指数(h)为0.3648~0.4382。广西雅长(GYC)和贵州万峰湖(QWF)居群具有较高的遗传多样性(h=0.4382,h=0.4276),广西木论(GML)居群具有最低的遗传多样性(h=0.3648)。分子方差分析(AMOVA)结果表明,遗传变异主要发生在居群内个体间(94%),而居群内遗传分化很小(6%)。基于遗传距离构建的UPGMA聚类分析结果显示,6个居群遗传距离较小,居群间遗传距离和地理位置不完全相关。Structure和主坐标分析结果表明,居群间存在均质化现象,无明显类群划分。综上,带叶兜兰资源遗传多样性较为丰富,研究结果可为中国西南地区野生带叶兜兰资源的保护和利用提供理论依据。

不同培养基组分对带叶兜兰离体培养效果的影响

【目的】探讨适宜带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)离体培养的培养基组分,为规模化生产带叶兜兰组培苗提供技术支持。【方法】以带叶兜兰组培苗为外植体,筛选适合其丛生芽诱导、增殖和壮苗生长的基本培养基、附加物种类和生长激素组合。【结果】初步筛选出较适宜带叶兜兰丛生芽诱导的培养基为1/2MS+3.0 mg/L BA+0.1 mg/LNAA+80.0 g/L香蕉汁+2.0 g/L活性炭,其诱导率较高,为36.1%,且丛生芽诱导出芽较多;丛生芽增殖培养基为1/2MS+0.1 mg/L TDZ+3.0 mg/L 2,4-D+80.0 g/L香蕉汁+2.0 g/L活性炭,其增殖系数为2.02,芽生长较快;壮苗生长最适宜培养基为1.0 g/L花宝1号+1.0 g/L花宝2号+MS培养基的有机、微量成分+1.0 mg/LNAA+2.0 g/L活性炭+80.0 g/L香蕉汁+1.5g/L蛋白胨,其幼苗生长较好,生物量大,生根率达75.5%。【结论】在1/2MS+3.0 mg/L6-BA+0.1 mg/LNAA+2.0 g/L活性炭培养基中添加香蕉汁较适宜带叶兜兰丛生芽诱导和增殖培养;在1/2MS+80.0g/L香蕉汁培养基中添加0.1 mg/LTDZ+3.0 mg/L 2,4-D对带叶兜兰的增殖效果较佳;花宝改良培养基适宜带叶兜兰壮苗培养,结合添加NAA和活性炭培养效果更佳,但活性炭浓度不宜过高。

有益菌根真菌及其互作对带叶兜兰试管苗生理生长的影响

为探讨菌根真菌的互作效应,筛选协同互作模式组合,对从野生兜兰新鲜营养根中分离、筛选出的3种菌根真菌(PF02、PF06和PF07),采用单菌接种、双菌混合接种和三菌混合菌种等7种接种方式,开展菌−苗共生培养,筛选出优势菌株PF02和PF07,揭示在实验室环境下接菌方式与接种效应之间的相互联系,分析菌根真菌互作对带叶兜兰植株生长和生理的影响。结果表明:显示菌根真菌互作对宿主植株的生物量、保护酶活性及叶绿素总量具有较好的正向效应。3种双菌混合接种方式PF02−PF06、PF02−PF07及PF06−PF07均能有效促进带叶兜兰生物量增长,尤其是PF02−PF06接种方式,抗氧化酶POD、超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT活性及叶绿素总量提高显著。选择优化的接种方式,以及能够协同促进、达到共生平衡的最佳接种方式组合,最大限度发挥菌根对宿主植物的益生作用。

带叶兜兰成花过程中叶片内源激素与多胺含量的变化动态

近些年兜兰产业发展迅速,但花期调控难成为限制兜兰产业发展的瓶颈。以带叶兜兰为试验材料,采用高效液相色谱分析的方法,研究带叶兜兰开花期间叶片中内源激素及多胺含量的变化规律,分析内源激素及多胺对其开花的影响。结果表明,高水平的ZT、IAA、GA_(3)、多胺含量和GA_(3)/IAA比值有利于带叶兜兰花芽分化;带叶兜兰花朵形态建成需要更高水平的ZT、IAA、GA_(3)、多胺含量和Spd/Put、Spm/Put比值;带叶兜兰叶片GA_(3)具有调控IAA水平和Put水平的作用,多胺和激素之间存在密切的关系。

带叶兜兰种子原地共生萌发及有效菌根真菌的分离与鉴定

为获得带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)种子萌发的共生真菌,采用原地共生萌发技术获得了2株自然萌发的小幼苗,并分离和筛选出了有效的种子萌发共生菌——瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)。为验证分离菌株对带叶兜兰种子萌发的有效性,将Phs34号菌株与带叶兜兰种子在灭菌后的原生境基质上进行室内共生萌发试验,结果表明,经过6周的培养,对照组没有观察到种子的萌发;接菌的种子胚明显膨大,突破种皮,形成原球茎,平均萌发率为(58.35±3.41)%。这表明分离得到的瘤菌根菌能促进带叶兜兰的种子萌发。

野生兜兰菌根真菌对带叶兜兰生长和生理指标的效应

为探究兰科菌根真菌对带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)生长的影响,用4个分离自广西野生兜兰根部的兰科菌根真菌(Cladosporium perangustum、Kirschsteiniothelia tectonae、Phialophora sp.和Cyphellophora sp.)与带叶兜兰试管苗和营养钵苗进行菌-苗共生试验,对其生长和生理指标的变化进行了研究。结果表明,接菌处理具有明显的促进生长作用和生理效应,Cladosporium perangustum和Phialophora sp.对试管苗的接种效果最佳,鲜质量增量、3种保护酶活性和叶绿素总量均与对照存在显著或极显著差异,鲜质量增加了360%~380%。Kirschsteiniothelia tectonae、Phialophora sp.对营养钵苗的接种效果最佳,鲜质量增量、叶面积及3种保护酶活性均与对照存在显著或极显著差异,鲜质量增加了261%~330%。因此,实际生产中可在带叶兜兰不同生长阶段接种适当菌株,Phialophora sp.对带叶兜兰表现出较好的促生效应,可研发为带叶兜兰育苗期通用型有益菌剂。

带叶兜兰遗传多样性的SRAP分析

【目的】从分子水平上了解带叶兜兰的遗传多样性，为带叶兜兰种质资源的保护和利用奠定基础。【方法】采用SRAP分子标记技术，对40份采自广西木论自然保护区天然居群的野生带叶兜兰种质资源进行分析，利用Popgene软件估算遗传多样性参数。【结果】从414对SRAP引物中筛选获得30对能扩增稳定、清晰可辨条带的引物组合；30对引物组合可从40份DNA样品中扩增获得256条带，每对引物扩增条带数为6～11条，平均每对引物组合扩增获得8．53条带；其中多态性条带62条，多态性比例为12．50％～33．33％，平均多态性比例为24．22％。遗传多样性分析结果显示，Nei’s基因多样性指数为0．1282，Shannon多样性指数为0．1582。【结论】带叶兜兰种质资源群体个体数少，个体间遗传多样性水平较低。

带叶兜兰根内与根区土壤的真菌群落组成分析

【目的】从分子水平上分析带叶兜兰根内和根区土壤的真菌群落组成,为带叶兜兰的保育和种群恢复提供参考依据。【方法】利用高通量测序技术对带叶兜兰根内和根区土壤真菌的18S rDNA进行扩增测序,分析带叶兜兰根内和根区土壤的真菌群落组成及根内真菌群落组成与根区土壤环境的相关关系。【结果】带叶兜兰根内不同样品间、根区土壤不同样品间真菌的操作分类单元(OTUs)存在差异,但根内的OTUs总数与根区土壤的OTUs总数差异不明显;带叶兜兰的根内真菌群落组成与根区土壤相似,但植株个体间的真菌群落组成存在差异。Alpha多样性分析结果显示,带叶兜兰根内和根区土壤的真菌群落多样性差异较小,真菌群落分化程度较低,丛赤壳科(Nectriaceae)和虫草科(Cordycipitaceae)真菌同为其根内和根区土壤的优势菌群。UPGMA聚类分析结果显示,所有根内和根区土壤的真菌群落均未聚在单独分支,说明根内样品的真菌群落种类和丰度与土壤样品差异较小。在真菌的特异性组成方面,优势菌群镰刀菌属(Fusarium)和虫草属(Cordycipitaceae)在根内和根区土壤中的相对丰度接近,分布较均衡。【结论】带叶兜兰根内与根区土壤的真菌群落具有相似结构,真菌群落的种类间和丰度间差异不明显,但根内与根区土壤共有多数种类的优势菌群。

带叶兜兰壮苗生根培养基及移栽基质选择

以带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)组培苗为外植体,研究5种培养基对带叶兜兰组培苗壮苗生根的影响,设计6种基质处理,以筛选组培苗出瓶后的最佳移栽基质。结果表明:初步筛选出较适宜壮苗生根的培养基为1/2MS+NAH2PO4170 mg/L+NAA 0.1 mg/L,植株生物量增加显著;随着NAA浓度的增加,植株的壮苗生根效果受到不同程度的抑制。单独利用腐熟过的碎树皮做基质,试管苗移栽成活率均达99.7%以上。

菌根真菌对带叶兜兰驯化苗的生长效应

为探究兰科(Orchidaceae)菌根真菌对带叶兜兰(Paphiopedilum hirsutissimum)驯化苗生长的影响,以Cladosporium perangustum、Kirschsteiniothelia tectonae、Phialophora sp.和Cyphellophora sp.4个分离自广西野生兜兰根部的兜兰有益真菌为供试菌株,开展带叶兜兰驯化苗的菌根化育苗试验,分析接菌处理对鲜重、根、叶片、萌芽和相对叶绿素含量的影响。结果表明,接菌处理在促进驯化苗生长方面优势明显,不同菌株在驯化苗不同生长阶段产生不同的效果。Phialophora sp.对1年生与2年生驯化苗生长的促进作用最大;C.perangustum有利于1年生与2年生驯化苗根系的生长发育,可增强叶片的光合作用;K.tectonae有利于1年生驯化苗根系的生长发育,可促进2年生驯化苗地上和地下部分的生长;Cyphellophora sp.有利于2年生驯化苗叶片的生长。在实际应用中,可在驯化苗的不同生长阶段接种有最佳促生效果的菌株;Phialophora sp.在带叶兜兰的两个生长阶段均表现出较好的促生效果,可作为带叶兜兰苗期的通用益生菌制剂,用于带叶兜兰的保育和栽培。

带叶兜兰5个野生居群表型多样性分析

以云南、广西、贵州的5个带叶兜兰主要野生居群分布区为研究对象,采用巢式方差分析、表型分化系数、主成分分析、相关分析、聚类分析等分析方法,对带叶兜兰的18个性状的表型多样性进行分析。结果显示:带叶兜兰表型性状在居群间表现出显著或极显著差异,居群内变异较少。带叶兜兰平均表型分化系数为75.18%,居群间的变异是居群多样性的主要来源;18个表型性状变异系数平均值的变化范围为6.36%~18.51%,离散程度较高。主成分分析表明,造成带叶兜兰表型变异的主要来源是株高、子房长、花茎高、最大叶长、花横径和合萼片长6个性状。Pearson相关分析表明,株高、合萼片宽和中萼片宽等与大部分性状均呈显著或极显著正相关;18个性状中只有合萼片长与地理因子极显著相关。聚类分析结果表明,5个居群大致依据地理距离聚为3个类群。本研究发现,带叶兜兰居群遗传多样性较高,居群间的变异远高于居群内的变异,因此,应尽可能保护更多的野生居群,在原地保护的基础上建立种质资源保存圃、库,进行人工繁殖和育种,以利用促保护。

基于ITS序列的带叶兜兰根内真菌群落组成分析

采用克隆文库技术对带叶兜兰根内真菌的ITS片段进行PCR扩增及高通量测序分析,共得到有效序列952589条,共产生1028个OTUs,共涉及6个门、21个纲、46个目、96个科、143个属、217个种及大量未分类种类。其中HJD样点根内真菌种类和数目最多,YM和LY样点根内真菌种类和数目次之,且这两个样点之间无显著区分。