par-4 SAC基因的克隆及序列测定

目的:利用基因工程技术对par-4 SAC进行基因克隆并测定其序列,为进一步诱导肿瘤细胞靶向性凋亡的基因治疗奠定基础。方法:采用非对称互补引物/模板法,制备两端含有酶切位点的par-4 SAC的cDNA,PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体并转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α菌株,随机挑取数个菌落,筛选鉴定并测序。结果:经酶切鉴定、测序分析,表明所插入的基因片断为par-4 SAC基因,与设计完全相同。结论:应用非对称互补引物/模板法克隆par-4SAC基因是成功及可行的。

SAC重组腺相关病毒载体的构建及其对前列腺癌CAM移植瘤的抑制作用

目的构建携带NT4-SAC-HA2-TAT融合基因的重组腺相关病毒载体,并感染前列腺癌鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)移植瘤,观察目的基因前列腺凋亡反应基因-4(par-4)选择性癌细胞凋亡结构域(SAC)的表达及其对CAM移植瘤的生长抑制作用。方法利用磷酸钙共沉淀法将包装质粒pAAV/Ad、腺病毒辅助质粒pFG140及重组穿梭质粒pSSCMV/NT4-SAC-HA2-TAT共转染293细胞,制备重组腺相关病毒(rAAV),斑点杂交法检测病毒滴度。取孵育9 d龄健康鸡胚,CAM接种前列腺癌细胞系PC-3细胞,建立前列腺癌的CAM移植瘤模型,接种3 d后挑选成瘤鸡胚随机分为3组:空白对照组(PBS),空病毒组(AAV)和重组病毒组(rAAV),观察瘤体生长情况,上述处理4 d后测量比较不同组移植瘤体积,并切片染色病理检查。免疫荧光法检测移植瘤中SAC融合肽的表达。结果酶切鉴定结果证实成功构建pSSCMV/NT4-SAC-HA2-TAT,斑点杂交法检测重组病毒滴度约为3.34×1010～3.34×1011cfu/mL。免疫荧光法证实SAC融合肽表达。移植瘤能在CAM上生长,可见瘤周围丰富毛细血管汇集,rAAV组瘤体显著缩小,病理HE染色可见瘤细胞局限及侵袭抑制。结论成功构建SAC重组腺相关病毒载体并感染前列腺癌CAM移植瘤,重组病毒表达分泌的SAC融合肽对前列腺癌CAM移植瘤具有诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭性增殖等作用。