基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构,明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能,选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间,设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上,利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况,鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系,敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础,同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。