猪源PIV5毒株的全基因组序列测定及其生长特性研究

副流感病毒5型(PIV5)是一种副黏病毒,能感染包括人、猪、牛、马、小熊猫、东北虎等在内的多种哺乳动物而没有明显的致病性。近年来,在我国多个地区和省份从多种动物体内分离到该病毒。参照PIV5 ZJQ-221株全基因组序列设计覆盖HLJ2015/DP2-1/PIV5株(GenBank登录号为MT890697)、JX/1221/2015/PIV5株(GenBank登录号为MT890700)基因组全长的10对引物,对2株PIV5进行RT-PCR分段扩增,扩增产物分别克隆至pMD19-T载体中,并对其进行序列测定、拼接和分析,并鉴定2株PIV5在Vero、LLC-PK1、ST、ST-R细胞上的生长状况。结果表明:2株PIV5基因组全长均为15 246 nt,同源性分析显示2株PIV5与其他23株PIV5序列同源性为97.0%~99.9%,系统进化分析显示其与中国猪源SH-1202株处于同一分支且亲缘关系最近。这一研究为PIV5的流行病学监测以及相关病原学特性研究提供了重要的参考资料。

猴副流感病毒SV5 PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。方法根据GenBank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。结果利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccⅢ限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。结论初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。

首例兽用活疫苗中污染副流感病毒5型的检测

从某企业送检的猪伪狂犬活疫苗中检出疑似血凝性外源病毒污染,经病原学和分子生物学鉴定,证实该疫苗污染了PIV5,并对我国主要猪用活疫苗中污染PIV5情况进行了摸底检测。将样品经伪狂犬病毒特异性阳性血清中和后,接种Vero细胞连传5代,可出现细胞圆缩、聚集、颗粒增多等细胞病变。纯净性检测显示该分离株无细菌污染、支原体污染和外源病毒污染。将该分离毒株F10代培养物进行病毒含量和HA效价测定,分别为10^(7.0)TCID_(50)/mL和1∶256。以PIV5单克隆抗体作为一抗进行IFA染色,可在感染细胞的胞浆中观察到典型的绿色荧光;采用针对PIV5的L基因设计特异性引物,经RT-PCR可扩增出277 bp特异性片段,经测序后与GenBank中已发表的8株PIV5序列进行同源性比较,同源性为93.1%～97.4%,其中与我国分离的来自小熊猫的PIV5ZJQ-221株(登陆号:KF100034.1)同源关系最近,为97.4%;其次与犬源、猴源、牛源的PIV5同源性均在95.5%以上,与猪源的PIV5同源性为93.3%～95.9%,同源性均较高。基因序列系统进化树分析显示同样的结果。以上试验证明疫苗中污染的病毒为PIV5,并命名为PIV5/01株。针对国内猪用活疫苗中污染PIV5情况的初步摸底检测显示,PIV5污染率约为16.7%,提示应加强疫苗中污染PIV5的预防和控制。

猴副流感病毒5型实时荧光定量PCR方法的建立与初步应用

目的建立猴副流感病毒5型（SV5）实时荧光定量PCR方法，并初步应用于猴样本检测。方法根据SV5病毒NP基因保守片段设计特异引物和TaqMan探针，使用分子生物学方法制备质粒标准品，建立SV5实时荧光定量PCR方法；对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定；并使用该方法对24个猴样品进行检测。结果成功建立SV5实时荧光定量PCR方法；该方法线性范围为（6．8×10^9～6．8×10^5）copy／μL，灵敏度为6．8copy／μL，批内变异系数（CV）为0．63％～8．71％，批间CV为1．52％-12．38％，而且方法特异性好；在24个猴肺样品中未检测出阳性。结论该方法的建立为实验动物和动物源性生物制品中SV5的定量检测奠定了基础。

副流感病毒5型荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立检测副流感病毒5型(PIV5)的荧光定量RT-PCR方法,针对PIV5 L基因设计筛选出一对特异性引物和探针,对退火温度、引物浓度、探针浓度进行了优化,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示:最适退火温度为54.7℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.1μmol/L。检测灵敏度为10 copies、0.8 TCID50,特异性结果显示与BPIV3等22种常见病毒及原辅材料均无交叉,重复性试验显示不同模板浓度重复检测变异系数均小于1.5%,重复性良好。

猴副流感病毒SV5的PCR检测方法建立及初步应用

[目的]建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。[方法]根据Genbank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。[结果]利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccIII限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。[结论]本文首次初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。

副流感病毒5型的分子生物学研究进展

副流感病毒5型(Parainfl uenza virus 5,PIV5)为一类不分节段单股负链RNA病毒,可引起多种动物呼吸道感染,尤其可致犬病发"犬窝咳"。本文围绕PIV5病毒特征、基因组特征、编码蛋白、病毒的转录与复制以及PIV5相关疫苗的研究做一综述,旨在为PIV5疾病监测和PIV5相关疫苗研究提供科学依据。

猪源副流感病毒5型SH毒株全基因组测序及分析

目的对猪源副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)SH毒株进行全基因组测序及分析。方法根据GenBank中登录的猪源PIV5基因组序列设计10对引物,采用RT-PCR法对各片段进行扩增、测序,并对获得的PIV5-SH株全基因组序列进行遗传进化性分析。结果 PIV5-SH毒株基因组长15 246 nt,与传统毒株PIV5-W3A核苷酸序列同源性为98.7%。基于全基因组构建的遗传进化树显示,PIV5-SH毒株与韩国犬源PIV5(1168-1)、中国孟加拉虎源PIV5(PIV5-HMZ)、中国东北虎源PIV5(PIV5-SR)及中国小熊猫源PIV5(ZJQ-221)具有较近的亲缘关系,与传统毒株W3A亲缘关系较远。进一步以PIV5 NP、F及HN基因构建遗传进化树显示,PIV5-SH毒株与PIV5 1168-1、PIV5-HMZ、PIV5-SR、PIV5 ZIQ-221和PIV5-CAN毒株亲缘关系近。结论 PIV5不同分离株基因差异较小,表现出一定的遗传稳定性。

虎源、小熊猫源副流感病毒5型的鉴定及F基因遗传进化分析

为探究副流感病毒5型（PIV5）的遗传变异状况，对PIV5的预防、诊断、治疗提供依据，于20142016年，收集疑似PIV5感染病例样品14份（小熊猫4份，非洲狮4份，东北虎1份，华南虎1份，环尾狐猴4份）做相应处理，接种VerO细胞并通过PcR检测，对检测到的PIV5的F基因进行扩增，连接目的片段至pMD19-T Simple Vector，测序并做序列分析。结果成功从华南虎、东北虎和小熊猫标本中分离出3株PIV5，分别命名为PIV5-SR，P1V5ST，ZJQ221。3株病毒接种到Vero细胞上，均能使Vero细胞出现空泡、拉网的现象。用相关软件分析该病毒F基因序列发现，3株病毒的F基因分别有5，6，4处突变；建立遗传进化树表明，3株病毒处同一分支，均与韩国犬源1168—1分离株亲缘关系最近。

猴副流感病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为对易感动物以及相关生物材料和生物制品进行猴副流感病毒(SV5)的快速病原检测,根据SV5病毒SH基因序列,设计了1对引物,建立了检测SV5的RT-PCR方法,通过优化确定了RT-PCR体系的最佳工作条件。核酸序列分析显示,所扩增片段与GenBank数据库中报道的SV5病毒株WR-21005序列同源性达到97%,证明该方法特异。敏感性分析显示,该方法可检测的最小RNA浓度为2.1 ng/μL,能检出的最小病毒滴度为3.98CCID50/0.1 mL。初步将该方法运用于猴、地鼠、常用传代细胞和猴源生物制品的检测,在所检测的样品中均未检出猴副流感病毒核酸序列。结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于猴副流感病毒(SV5)的诊断和分子流行病学调查。

副流感病毒5型载体研究进展

负链RNA病毒的反向遗传学技术是一种新兴的分子生物学技术,作为负链RNA病毒的副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5),是一种极具应用潜力的重组病毒活载体。现结合PIV5病毒载体特征,对其重组病毒的反向遗传学及其应用等做简要综述。

副流感病毒5型CC-14株辅助质粒的构建及鉴定

目的构建副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)CC-14株核衣壳蛋白(nucleoprotein,NP)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和聚合酶蛋白(large protein,L)基因真核表达质粒,并在MDCK细胞中表达,为该病毒反向遗传系统的建立奠定基础。方法根据PIV5 CC-14株全基因组中的NP、P和L基因分别设计特异性引物,经RT-PCR扩增得到NP、P和L基因,酶切后分别连接至pc DNA3.1+真核表达载体(或p MD18-T)上,构建辅助质粒pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L,转染MDCK细胞,RT-PCR检测NP、P和DL基因的转录情况。结果经双酶切及测序鉴定证明辅助质粒pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L构建正确,3个质粒转染MDCK细胞后,经RT-PCR分别可扩增得到NP、P和DL基因片段。结论成功构建了PIV5 CC-14株pc DNA3.1-NP、pc DNA3.1-P和pc DNA3.1-L辅助质粒,且均可在MDCK细胞中有效转录,为该病毒反向遗传系统的建立奠定了基础。

副流感病毒5型RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了精准和快速检测副流感病毒5型(PIV5),本研究下载NCBI中发布的不同物种来源的25株PIV5全基因序列,对比后选择高度保守的NP基因序列区段设计特异性引物,建立了检测PIV5的RT-PCR方法。结果显示,建立的方法具有较强的敏感性和特异性,可扩增出115 bp大小的片段。敏感性结果显示,核酸最低检测量为7.93×10^(5)copies/μL,与牛副流感3型病毒等8种临床常见病毒均无交叉反应。分别采集猪、牛及犬的临床样品共40份进行检测,阳性率为20%,表明建立的RT-PCR方法可用于临床上副流感病毒的检测。

副流感病毒5包膜糖蛋白的结构与功能

副流感病毒5(Parainfluenza virus 5,PIV5)属于单股负链不分节段的RNA病毒,迄今尚未发现PIV5与人类已知的疾病有关,主要被用作疫苗载体。其包膜上存在三种糖蛋白:融合(Fusion,F)蛋白、血凝素-神经氨酸酶(Hemaggulatinin-neuraminidase,HN)蛋白、小疏水性(Small hydrophobic,SH)蛋白。F蛋白能在同源性HN蛋白的协助下介导膜融合,HN蛋白具有受体识别、神经氨酸酶活性和促细胞融合活性,SH蛋白则在病毒致病机制中起作用。本文主要阐述了三种包膜糖蛋白的结构和功能,旨在为PIV5的研究提供一些参考。

牛副流感病毒3型在不同细胞中的复制动力学分析

目的对牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)在Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞中的复制动力学进行分析。方法将BPIV3分别接种至Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE)情况;采用直接免疫荧光抗体法检测3种细胞盲传3代后BPIV3的增殖情况;将病毒滴度为1.0×104TCID50/ml的BPIV3分别接种至MDBK和Vero-E6单层细胞中,培养7 d,逐日测定各细胞中的病毒滴度。结果BPIV3在MDBK细胞中盲传1代即可观察到明显的CPE;在Vero-E6细胞中盲传2、3代可见CPE;在MRC-5细胞中盲传3代未见CPE。在MDBK细胞中盲传3代可检测到较强荧光信号;在Vero-E6细胞中盲传3代荧光强度较弱;在MRC-5细胞中盲传3代未检测到荧光信号。BPIV3在MDBK和Vero-E6细胞中分别于培养第5和6天时病毒滴度达峰值,分别为1.2×1010和1.0×105 TCID50/ml。结论 BPIV3在MDBK细胞中的复制动力强于Vero-E6细胞,最适用于培养该病毒,MRC-5细胞不适用于培养BPIV3。