Bone marrow-derived mesenchymal stem cells increase dopamine synthesis in the injured striatum

Previous studies showed that tyrosine hydroxylase or neurturin gene-modified cells transplanted into rats with Parkinson＇s disease significantly improved behavior and increased striatal dopamine content. In the present study, we transplanted tyrosine hydroxylase and neurturin gene-modified bone marrow-derived mesenchymal stem cells into the damaged striatum of Parkinson＇s disease model rats. Several weeks after cell transplantation, in addition to an improvement of motor function tyrosine hydroxylase and neurturin proteins were up-regulated in the injured striatum, and importantly, levels of dopamine and its metabolite 3,4-dihydroxyphenylacetic acid increased significantly. Furthermore, the density of the D2 dopamine receptor in the postsynaptic membranes of dopaminergic neurons was decreased. These results indicate that transplantation of tyrosine hydroxylase and neurturin gene-modified bone marrow-derived mesenchymal stem cells increases dopamine synthesis and significantly improves the behavior of rats with Parkinson＇s disease.

抗帕金森病新药的研发进展

目的综述多巴胺能药物和其他新型治疗药物的研发状况,为国内的科研人员提供参考。方法分析了帕金森现有的主要治疗药物多巴胺能,包括左旋多巴胺、多巴胺受体激动剂、儿茶酚氧位甲基转移酶抑制剂、单胺氧化酶抑制剂等;以及新型的抗帕金森药物,包括α2-肾上腺素能受体拮抗剂、腺苷A2A受体拮抗剂、细胞治疗和基因治疗的基本原理、药物研发的进展情况。结果与结论帕金森病是一种渐进性的神经系统退行性疾病,在全球的发病率较高。新型治疗药物的研发成功有望缓解帕金森病人的痛苦,提高其生命质量,但新型药物的上市还有很长的过程。

GDNF重组腺病毒增加MN9D细胞多巴胺合成与释放

有表达ＧＤＮＦ的重组腺病毒直接感染中脑多巴胺能神经元来源的ＭＮ９Ｄ细胞并经神经毒素ＭＰＰ＋处理．感染３６ｈ分别收获细胞及其培养基，用反相高效液相色谱方法测定多巴胺含量．结果显示，经ＧＤＮＦ重组腺病毒感染的ＭＮ９Ｄ细胞内及其培养基中的多巴胺水平分别增加５０．７％和５３．５％．给予神经毒素ＭＰＰ＋损伤后，细胞内多巴胺含量降低５３．５％，但同时给予ＧＤＮＦ腺病毒则可抑制这种降低，并使多巴胺水平增加１４１．３％．以上结果提示ＧＤＮＦ腺病毒可提高细胞内的多巴胺水平并促进其释放，同时还具有对抗神经毒素ＭＰＰ＋损伤作用，表明ＧＤＮＦ重组腺病毒用于帕金森氏病基因治疗具有良好的前景．

大鼠实验性帕金森病的基因治疗

将稳定转染了大鼠酪氨酶羟化酶（Ｔｙｒｏｓｉｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ＴＨ）基因的大鼠成肌细胞移植于帕金森病大鼠模型的纹状体，进行基因治疗研究。ＲＴ－ＰＣＲ和免疫组织化学检测都证明转基因细胞可在纹状体内存活并表达ＴＨ，动物的不对称旋转行为明显改善，而且疗效可维持半年以上。

转基因成肌细胞脑内移植后帕金森病大鼠纹状体多巴胺含量的变化

为评价转鼠酪氨酸羟化酶（TH）基因的成肌细胞脑内移植对偏侧帕金森病（PD）大鼠模型纹状体区多巴胺及代谢产物含量的影响，应用6－羟多巴胺损毁SD大鼠单侧黑质制备偏侧帕金森病臣模型。模型稳定必个月后，移植转TH基因的成肌细胞（n＝24）或未转基国的成肌细胞（n＝10）于偏侧PD鼠损毁侧纹状体。移植治疗后6个月，用高效液相色谱电化学法（HPLC－ECD）检测偏侧PD鼠模型纹状体区多巴胺、3，4－二羟苯乙酸（DOPAC）以及高香草酸（HVA）含量。结果转TH基因成肌细胞植入组PD鼠纹状体区多巴胺及代谢产物含量明显增高（P＜0．01），其中多巴胺含量从治疗前平均39．20Pg／mg提高至治疗后的985．71Pg／mg，相当于正常侧纹状体的49．99％．对照组植入未转基因的成肌细胞后纹状体多巴胺及代谢产物含量无明显变化（P＞0．05）。可见转鼠TH基因的成肌细胞脑内移植能够部分改善偏侧PD鼠模型纹状体区多巴胺的缺乏，成肌细胞是PD基因治疗的合适靶细胞之一。

脑源性神经营养因子基因治疗对大鼠脑内多巴胺含量的影响

采用脑源性神经营养因子（BDNF）基因工程成肌细胞纹状体内移植观察其对帕金森病（PD）大鼠脑内纹状体多巴胺含量的影响，结果发现：基因工程成肌细胞脑内移植可使纹状体多巴胺含量明显增加，并可维持达两月之久，这为帕金森病的治疗提供了一种新的有效的治疗方法。

Ⅱ型人多巴胺受体逆转录病毒载体的构建及表达

目的构建人全长D2R基因真核表达载体,研究D2R在帕金森病(PD)中的作用和机制。方法将D2RcDNA片段克隆于pLNCX2逆转录病毒载体,转染成纤维包装细胞系PT67,G418筛选单克隆后进行传代培养,通过原位杂交、免疫组织化学和Westernblot检测其表达效果。病毒上清再感染骨髓基质细胞(MSCs),免疫荧光检测D2R基因表达率。结果成功构建了逆转录病毒表达载体pLNCX2_D2R,原位杂交证实D2R基因在PT_67表达的阳性率为80%以上,免疫组织化学检测可见其蛋白分布在胞浆和胞膜,细胞裂解后Westernblot蛋白电泳可检测到约48·84kD的蛋白。经转染D2R基因的PT67细胞能分泌病毒并感染MSCs。结论逆转录病毒介导的D2R基因经PT67细胞包装后,能够产生病毒颗粒,收集含病毒颗粒的上清可进一步感染MSCs,这种经逆转录病毒介导的DR基因可用来作针对帕金森病进行基因治疗的研究。

芳香族氨基酸脱羧酶转基因骨骼肌细胞脑内移植后对纹状体区多巴胺含量的影响

目的 探讨帕金森病 (PD)大鼠模型脑内移植人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因对PD的治疗作用及其在左旋多巴 (L dopa)治疗过程中的地位 ,并检测脑内多巴胺含量的变化。方法 将 pCDNA3 AADC转染的原代培养的骨骼肌细胞 ,移植于SD大鼠PD模型毁损侧纹状体 ,并在此基础上予以外源性L dopa 10mg·kg-1·d-1腹腔内注射 ,分别观察基因治疗前后以及结合给予外源性L dopa前后各组动物病理性旋转行为的改善 ,并行高效液相电化学法检测脑内多巴胺(DA)含量。结果 AADC转基因骨骼肌细胞脑内移植后 ,实验组PD模型大鼠旋转行为较前明显改善 ,并可持续 15周以上 ,尤以第 11周时最为明显 ,约为 6 4 6 % (P <0 0 5 ) ,结合外源性L dopa治疗后动物模型的旋转行为有更进一步的改善 ,达到 86 5 % ;脑内DA含量测定证实 ,PD模型鼠脑内AADC水平较健康鼠明显降低 ,仅 (2 119 0± 4 7 2 )ng/mg ,约为健康鼠的 31 0 % ;在补充了AADC后 ,脑内纹状体区DA含量则显著提高 ,达到 (390 7 5± 5 6 3)ng/mg ;结合补充外源性L dopa后 ,脑内DA的水平得到进一步提高达 (5 4 4 3 0± 78 7)ng/mg。 结论 脑内植入AADC转基因骨骼肌细胞 ,增加了脑内AADC基因的表达 ,可有效改善帕金森病大鼠的旋转行为 ,并可通过增加对L dopa的脱羧?

转基因成肌细胞移植治疗帕金森病的实验研究

评价转基因成肌细胞移植治疗帕金森病（ＰＤ）的疗效。方法移植转酪氨酸羟化酶（ＴＨ）基因的成肌细胞（ｎ＝２４）和未经遗传修饰的成肌细胞（ｎ＝１０）于偏侧ＰＤ鼠损毁侧纹状体。用阿朴吗啡（ＡＰＯ）诱发旋转行为，反向聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、ＴＨ免疫组化检测ＴＨ基因的表达和ＴＨ蛋白的合成以及高效液相色谱仪－电化学检测器（ＨＰＬＣ－ＥＣＤ）检测纹状体多巴胺及代谢产物含量以此评估基因治疗的效果。结果治疗组移植治疗后ＡＰＯ诱发的旋转行为明显改善（Ｐ＜０．０１），且可持续１３个月，而对照组ＡＰＯ诱发的旋转行为无改善（Ｐ＞０．０５），应用ＲＴ－ＰＣＲ、ＴＨ免疫组化和ＨＰＬＣ－ＥＣＤ在治疗组移植部位检测到ＴＨ基因的表达、ＴＨ蛋白的合成和移植侧纹状体部多巴胺及其代谢产物含量增高。结论遗传修饰的成肌细胞能够在体内长时间、有效地表达ＴＨ，并改善ＰＤ鼠的病理行为，是ＰＤ基因治疗的合适靶细胞之一。

帕金森病基因治疗的实验研究

帕金森病(PD)的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元变性,表达的酪氨酸羟化酶(TH)减少或者活性降低。目前外源性多巴是最有效的抗PD药物,但常在数年后失去其有效的治疗作用。用胚胎脑细胞移植虽有效果,但胚胎脑来源困难。因此需要探索新的有效治疗方法。本研究将遗传修饰的成肌细胞植入偏侧PD鼠模型纹状体进行基因治疗。移植转TH基因的成肌细胞(治疗组,n=24)和未经遗传修饰的成肌细胞(对照组,n=10)于偏侧PD鼠损毁侧纹状体。用阿朴吗啡(APO)诱发旋转行为,RT-PCR、TH免疫组化检测TH基因的表达和TH蛋白的合成以及HPLC-ECD检测纹状体多巴胺及代谢产物含量以此评估基因治疗的效果。治疗组移植治疗后APO诱发的旋转行为明显改善(P<0.01),且可持续13个月,而对照组APO诱发的旋转行为无改善(P>0.05),应用RT-PCR、TH免疫组化和HPLC-ECD在治疗组移植部位检测到TH基因的表达、TH蛋白的合成和移植侧纹状体部多巴胺及其代谢产物含量增高。遗传修饰的成肌细胞能够在体内长时间、有效地表达TH,并改善PD鼠的病理行为,是PD基因治疗的合适靶细胞之一。

过表达多巴胺脱羧酶、酪氨酸羟化酶和三磷酸鸟苷环化水解酶1重组慢病毒构建及其在帕金森病大鼠模型治疗作用的研究

目的构建同时表达3种多巴胺(DA)合成相关酶的重组慢病毒(rLV),验证其在6-羟基多巴胺(6-OHDA)帕金森病(PD)大鼠模型中治疗作用,为PD临床基因治疗提供实验基础。方法构建过表达多巴胺脱羧酶(DDC)、酪氨酸羟化酶(TH)和三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)rLV及对照rLV。6-OHDA制备的PD模型大鼠,随机分为生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果 PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);阳性病毒组呈现显著的旋转行为改善。免疫荧光显示阳性病毒转染表达有TH活性的阳性细胞。阳性病毒组纹状体内DA及其代谢产物与生理盐水组、阴性病毒组比较,显著增高(P<0.01)。结论成功构建过表达DDC+TH+GCH1-rLV,并且在PD模型大鼠中呈现显著的行为改善及DA水平增加,为PD的基因治疗提供实验基础。

CDNF-BMSCs移植治疗帕金森病的试验研究

采用Lipo 2000试剂将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CDNF(大脑多巴胺能神经营养因子)转染至骨髓间充质干细胞(BMSCs);确认构建CDNF-BMSCs成功后,以脑立体定位技术为帕金森病(PD)模型大鼠进行纹状体内CDNF-BMSCs移植治疗;在治疗后不同时间点检测试验动物的旋转行为;利用免疫组织化学、WB技术检测纹状体内CDNF及酪氨酸羟化酶(TH)的表达变化,探讨CDNF-BMSCs移植治疗PD的效果。结果表明:细胞移植治疗2周后,CDNF-BMSCs组大鼠的行为学显著改善,纹状体内CDNF蛋白表达量极显著增加、TH蛋白表达量显著增加;同时,CDNF-BMSCs组动物脑纹状体内CDNF、TH阳性细胞数均随时间逐渐增多。这一研究为基因治疗PD等神经退行性疾病提供了试验依据。