两种超排卵剂量鼠胚实验对辅助生殖实验室质控的探讨

目的探讨采用两种超排卵剂量下的鼠胚实验对辅助生殖实验室进行质控的可行性。方法对SPF级昆明雌性小白鼠行腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)和绒毛膜促性腺激素(HCG)超排卵,在采用8 IU PMSG+8 IU HCG和16 IU PMSG+16 IU HCG两种不同注射剂量下进行体外受精和体内受精,观察不同剂量、不同受精方式下鼠胚发育的优胚率和囊胚形成率。结果分别实施8 IU PMSG+8 IU HCG超排卵剂量与16 IU PMSG+16 IU HCG超排卵剂量后,雌性小鼠体外受精,鼠胚优胚率分别为90.965%和81.877%,囊胚形成率分别为82.341%和75.081%,差异有统计学意义(P<0.05);雌性小鼠体内受精,鼠胚优胚率分别为93.096%和85.889%,囊胚形成率分别为83.432%和76.994%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用两种超排卵剂量下的鼠胚实验对辅助生殖实验室进行质控具有可行性,恰当的超排卵剂量,能获得较高的优胚率和囊胚形成率。

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的 探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法 本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果 各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论 遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。

不同培养液对昆明小鼠体外受精率及早期胚胎体外发育的影响

在TYH受精液中添加促卵泡素(FSH)和苯甲酸雌二醇(E2),检测不同浓度的FSH和E2对昆明小鼠的体外受精率的影响;检测在M16、CZB两种培养液中添加胎牛血清(FCS)与否对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响.结果表明:在TYH中添加1.0 IU/mL FSH,受精率和2-细胞胚率显著高于对照组;在TYH中添加0.1μg/mL E2,受精率和2-细胞胚率也显著高于对照组.在CZB中添加体积分数为10%FCS,可显著减少2-细胞期体外发育阻断,并显著提高小鼠胚胎体外发育的囊胚率,可见,以TYH添加1.0 IU/mL FSH和0.1μg/mL E2为受精液,以含体积分数为10%FCS的CZB为胚胎培养液,小鼠胚胎可获得较高的囊胚率.葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的.

不同遗传背景小鼠的超排与体外受精率的比较研究

对不同遗传背景小鼠的超数排卵效果和体外受精率进行比较研究,以探索建立不同遗传背景小鼠资源冷冻胚胎库的方法。选用35个不同遗传背景的小鼠品系(其中:7个近交系、3个同类系、3个封闭群、22个突变系)分别进行超排和体外受精,观察其超排数、异常卵率及体外受精率。结果显示各品系小鼠的平均超排卵数在11.8～38.7个之间;异常卵率为0.2%～32.2%;体外受精率15.2%～97.2%.证明不同遗传背景的小鼠超排卵数、异常卵率及体外受精率差异显著(P<0.05)。

小鼠卵母细胞体外成熟培养系统的建立与优化

目的探讨激素刺激时间、体外培养时间对小鼠卵母细胞核成熟及不同激活方案对卵母细胞孤雌激活、胚胎发育能力的影响。方法孕马血清促性腺激素(PMSG)超排处理,在体外培养的不同时间点检测卵母细胞核成熟率(每个处理至少重复3次,3只/重复,以下实验相同)。分别采用乙醇结合6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)法和SrCl2法激活卵母细胞,胚胎培养液选用CZB[胎牛血清(FBS)或牛血清清蛋白(BSA)]两种,确定最佳激活方案。对不同时间点成熟的卵母细胞进行激活,确定最佳激活卵龄。研究缩短PMSG刺激时间对卵母细胞发育的影响。结果将PMSG刺激时间从46h缩短至24h,卵母细胞获得最高核成熟率(97.6%vs 91.9%)的培养时间由14h延长至16h;缩短PMSG刺激时间,核成熟率不受影响,但能显著降低激活率(91.2%vs 37.1%)和囊胚率(20.9%vs0.0%)。两种方法体内成熟卵母细胞激活率均高于90%,但囊胚率差异显著(P<0.05)。卵母细胞体外培养至24～26h时,激活率(89.5%)和囊胚率(21.9%)均达到最高点。结论建立了一种小鼠卵母细胞体外成熟培养系统,即PMSG超排处理46h、卵母细胞培养24h,CZB(10mmol/L SrCl2)激活2.5h后采用CZB(0.5%BSA)进行胚胎培养。

猪卵母细胞第一极体排出与否对其早期胚胎发育的影响

探讨猪卵母细胞第一极体排出与否对其体外受精和孤雌激活后早期发育的影响.从屠宰场收集猪卵巢卵母细胞,体外成熟培养42～46 h后分为3组:排出第一极体组、没有排出第一极体组和对照组(不挑选第一极体卵母细胞),进行体外受精或化学孤雌激活之后放入胚胎培养液进行体外培养,分别于第48 h和第168 h统计分裂率和囊胚率.①体外受精后,有极体组的卵裂率略高于无极体组和对照组的卵裂率(62.19%±6.99%vs 55.40%±6.80%和56.33%±8.17%),各组间没有显著差异(p>0.05);囊胚率分别为4.87%±3.77%,2.33%±1.34%和3·50%±2.96%,有极体组明显高于无极体组(p<0.05),对照组与其它两组没有显著差异(p>0.05).②化学激活后,有极体组的卵裂率高于无极体组和对照组(75.45%±1.35%vs 64.81%±2.07%和69.64%±2.51%,p<0.05);有极体组的囊胚率也高于无极体组和对照组(24.54%±4.34%vs 12.96%±3.99%和18.75%±1.87%,p<0.05).排出第一极体卵母细胞比没有排出第一极体卵母细胞的发育能力强,但没有排出第一极体卵母细胞经体外受精或人工激活后也可以发育到囊胚阶段.

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法,观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果,探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF),受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理,受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92.3%对64.7%),且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59.2%对64.7%),但差异不显著;用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55.3%和35.6%)显著高于mCZB(13.3%和8.1%)和M16培养液(17.3%和14.7%),后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液,不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞,且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养,其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。

人类体外受精培养液内毒素水平的评价

目的:检测人类体外受精使用的商品性培养液的内毒素水平,评价人精子存活试验和小鼠2-细胞发育试验测试内毒素的差异。方法:36批次的商品性体外受精培养液,使用前(A组,n=36),及使用后的其中25份样品(B组,n=25)采用鲎试验法检测内毒素水平。另对比人精子存活试验和2-细胞胚胎发育试验的敏感性。结果:A组样品无内毒素阳性检出,B组有2份样品检出内毒素。A组和B组样品24h精子活动率改变与对照组比无显著性差异(P>0.05),但A组中有3份样品抑制小鼠2-细胞胚胎的发育。结论:体外培养环境和实验操作须防止内毒素污染。虽然商品性培养液未检出内毒素,仍须对其作严格的质量控制。人精子存活试验测试培养液质量和低内毒素水平的敏感性低于小鼠2-细胞发育试验。

鼠胚实验在新建IVF胚胎培养室中的质控研究

目的:利用昆明系小白鼠行体、内外受精技术,对新建IVF胚胎培养室及技术员操作水平进行评估。方法:①手术获得昆明小白鼠雌雄配子,行体外受精;②手术获得昆明小白鼠体内受精胚(原核胚);培养观察两组鼠胚的受精率、卵裂率、囊胚率。结果:共进行24个周期的体外受精实验,取卵938枚,受精率89.87%、卵裂率96.32%、囊胚率95.39%;共进行24个周期的体内受精实验,取卵916枚(包括原核胚),受精率96.29%、卵裂率97.21%、囊胚率93.57%。结论:两组鼠胚实验结果表明,体内受精胚在体外发育更稳定,其对新建IVF胚胎培养室能够进行很好的质量控制;体外受精胚随小鼠批次及饲养环境等不同,在体外培养时其受精率、2-细胞率等会发生波动,但其对技术人员的操作水平能进行更好的评估;两者结果均能对新建胚胎培养室进行各项质控的监测。

克服昆明小鼠早胚2-细胞阻滞的研究

目的 :评价两种培养液对昆明小鼠胚胎 2 -细胞阻滞的克服效果 .方法 :用添加 15%FCS或BSA的M16和CZB培养液培养昆明小鼠 2 -细胞胚胎和体外受精卵 ,以观察这两种培养液对昆明小鼠早胚发育的影响及在克服昆明小鼠 2 -细胞阻滞中的作用 ,并通过CZB培养液中葡萄糖成份的增减 ,了解其作用及效应时间 .结果 :添加FCS的M16和CZB培养液均能较好地支持 2 -细胞胚胎发育到囊胚 ( 78 9% ,72 7% ) .当进行体外受精卵培养时 ,胚胎在M16培养液中仅有7 4 %突破 2 -细胞阻滞 ;但在CZB培养液中 ,有 72 3%能发育通过 2 -细胞期 ,并有 17%到达囊胚 .进一步 ,于培养的第 3d在CZB培养液中加入葡萄糖 ,其桑椹胚以上及囊胚发育率明显提高( 66 7%、2 8 1% ) .结论 :昆明小鼠体外受精卵在含 15%FCS的CZB培养液中可较好地克服 2 -细胞阻滞 ,并形成囊胚 .在培养的第

鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用

目的:检测新建体外受精实验室培养体系的可靠与否,是否符合人类胚胎体外培养的要求。方法:对昆明白小鼠进行超促排卵,手术获取昆明白小鼠雌雄配子进行体外受精和体内受精的胚胎;并进行体外培养观察两组鼠胚的受精率、2-细胞率、囊胚率及采用密度梯度离心法和上游法两种精液处理方法对小鼠体外受精胚胎发育情况的影响。结果:进行了30个周期的体内受精体外培养实验,共获卵1136枚;进行了35个周期的体外受精实验,共获卵1486枚。体内受精组获得的受精率(93.13±1.46)%和2-细胞率(94.52±1.67)%高于体外受精组的受精率(84.39±2.87)%和2-细胞率(87.80±3.21)%,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。密度梯度离心法处理精液后,其受精率(90.32±3.14)%和2-细胞率(88.54±2.28)%高于上游法的受精率(76.46±2.35)%和2-细胞率(82.67±2.62)%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:小鼠卵母细胞体内受精和体外受精后均有高的成胚率,体内受精后进行体外培养优于体外受精后培养,采用密度梯度离心处理精液实施体外受精优于上游法,鼠胚实验可对新建胚胎培养室的培养体系进行评估。

小鼠孤雌生殖的胚胎干细胞的初步研究

比较去透明带孤雌桑葚胚和留透明带孤雌囊胚、体内受精胚胎、体外受精胚胎在饲养层上囊胚的扩张率、贴壁生长率.结果表明去透明带孤雌桑葚胚比留透明带孤雌囊胚的扩张率显著(p<0.05)提高,而贴壁率则极其显著地(p<0.01)提高,此外前者还发生增殖.但孤雌胚胎的囊胚扩张率、贴壁率和增殖率均极其显著地(p<0.01)低于体内受精胚胎和体外受精组;体内受精胚胎的体外发育最佳.说明去透明带孤雌桑葚胚比留透明带孤雌囊胚更利于在饲养层上贴壁生长,为建立孤雌生殖的胚胎干细胞系提供了基础.

新建体外受精实验室中挥发性有机化合物对鼠胚体外发育的影响

目的:探讨新建成的体外受精(IVF)胚胎实验室挥发性有机化合物(VOC)的浓度变化及不同浓度VOC环境下对小鼠IVF和胚胎发育的影响和去除实验室内VOC的方法。方法:按照胚胎在培养环境中是否接触培养室内空气分为实验组和对照组,在实验室装修后每个月测定两组中VOC水平,比较两组不同浓度的VOC对小鼠体外受精率、2-细胞率、卵裂率和囊胚率的影响,比较排风扇抽风、Coda空气净化器和单纯活性炭吸附去除室内VOC的效果。结果:1装修后第1个月,实验组VOC浓度高于对照组(384.00±5.16 ppb vs 199.00±2.58 ppb,P<0.05);装修后第2个月,实验组VOC浓度高于对照组(279.50±3.70 ppb vs 201.75±3.50 ppb,P<0.05);装修后第3个月两组VOC浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2装修后第1、2个月时实验组受精率、2-细胞率、卵裂率和囊胚率低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);装修后第3个月时两组以上4项指标差异无统计学意义(P>0.05)。3空气净化器的VOC去除率[(60.15±2.18)%]明显高于排风扇抽风[(51.88±2.23)%]和单纯活性炭吸附[(28.95±1.35)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论:实验室内高浓度的VOC会对小鼠IVF胚胎造成严重的胚胎毒性,导致胚胎质量下降和发育受阻;空气净化器是一种有效地去除实验室内VOC的方法。

新建辅助生殖实验室的鼠胚培养质控及鼠卵显微注射分析

目的利用小鼠体外受精法和体内受精法胚胎培养检测新建辅助生殖实验室的质控情况,分析比较常规人卵显微注射模式与鼠断尾精子显微注射模式的结局。方法利用昆明小鼠进行胚胎培养质控分析,按照受精方式不同分为体内受精组和体外受精组;又根据显微注射方式的不同,分为常规人卵显微注射模式(C-ICSI组)和鼠断尾精子显微注射模式(D-ICSI组),分析比较不同方式的鼠卵ICSI结局。结果体内受精组的受精率显著高于体外受精组(91.90%vs. 81.59%,P<0.05),两组的卵裂率(94.24%vs. 93.39%)、囊胚形成率(85.97%vs. 81.67%)比较无显著性差异(P>0.05)。人卵显微注射系统应用于鼠ICSI时卵子存活率有降低的趋势,但C-ICSI组与D-ICSI组的卵子存活率比较无显著性差异(29.49%vs. 30.52%)(P>0.05);D-ICSI组的受精率(56.72%vs. 42.53%)、卵裂率(71.05%vs. 43.24%)及囊胚形成率(61.11%vs. 31.25%)显著高于C-ICSI组(P<0.05)。结论昆明小鼠配子体外受精法和体内受精法胚胎培养的囊胚形成率均达到辅助生殖实验室的质控标准。人卵显微注射系统应用于鼠卵ICSI时,仅适用于卵子的显微注射操作练习。

小鼠电激活孤雌胚胎早期体内外发育能力的比较

目的探讨小鼠电激活孤雌胚胎的早期体内、外发育能力。方法 利用不同电脉冲参数和激活液对小鼠卵母细胞进行活化,观察激活后的小鼠孤雌胚体外发育状况和移植后的发育能力。结果非电解质激活液优于电解质液,脉冲强度、脉冲宽度和脉冲次数3个参数各自处于某一范围内时,他们之间存在某种相关性,降低其中1个参数可通过升高另外2个参数得到补偿,经筛选较适宜的电脉冲参数为:1.0 kV/cm、40μs、2 p,或者1.5kV/cm、30/μs、2 p,分别为74.65%和71.19%,体外囊胚发育率分别为43.40%和47.62%。电激活孤雌胚体外发育时序比正常胚胎慢,但囊胚细胞数与对照组差异不显著。它们经胚胎移植后,其中的一部分能够着床,但着床率仅为3.6%,极显著低于对照组(67%,P<0.01)。结论电刺激能够较好地模拟正常受精过程激活小鼠卵母细胞,但激活后的多数小鼠孤雌胚胎着床能力较低,不能够顺利着床。

卵泡液对牛卵母细胞发育潜力的影响

为了确定卵泡液(直径大于10mm)对卵母细胞成熟的影响,共收集1759枚卵母细胞进行试验。在成熟液中分别添加0%,10%,30%和50%的卵泡液(bFF,bovinefollicularfluid),成熟培养24h后,孤雌激活或者体外受精和胚胎培养;对比10%bFF和10%胎牛血清(FBS),以及观察微滴培养对卵母细胞成熟的影响。结果表明,在孤雌激活组中,bFF浓度对卵裂率的影响差异不显著,但胚胎囊胚发育率高于对照组(P<0.05);在体外受精组中随着bFF浓度增加而卵裂率下降(P<0.01),而且囊胚率也下降(P<0.05)。在10%的bFF组中,孤雌激活囊胚率和体外受精囊胚率分别为47.1%和38.0%,囊胚扩张率显著高于其它组。从试验得出,添加10%bFF有利于卵母细胞胞质成熟,且不会降低到受精率,而且可以替代FBS;微滴培养不利于卵母细胞成熟。

鼠胚实验在新建胚胎培养实验室质量控制中的作用

目的采用鼠胚实验(mouse embryo assay,MEA)检测新建的胚胎培养实验室的培养体系是否符合人类胚胎体外培养的要求。方法采用配子体外授精法和收集2细胞胚胎培养法进行实验。在胚胎体外培养的过程中定时对胚胎的发育状况进行观察并拍照记录。结果配子体外受精法的囊胚形成率为90.84%±7.09%。收集2细胞胚胎培养法的囊胚形成率为91.17%±6.97%。两种方法的囊胚形成率之间差异无显著性。结论配子体外授精法和收集2细胞胚胎培养法均可作为新建胚胎培养实验室的质量控制方法。

超短精卵共孵育时间对小鼠体外受精的影响

目的探讨不同精卵共孵育时间对小鼠体外受精受精率、氧化应激产生及胚胎质量的影响,及小鼠体外受精最短的精卵共孵育时间。方法分别比较ICR小鼠精卵共孵育30s、2min、10min、0.5h、2h、4h及18h的体外受精的受精率及囊胚形成率,并对精卵共孵育0h、2h及18h培养液的丙二醛浓度进行检测。结果各组获得卵细胞数分别为52、53、53、46、48、48及47,受精率分别为67.3%、81.1%、83.0%、87.0%、85.4%、81.3%及48.9%。精卵共孵育30s组的受精率显著低于0.5h及2h组(P<0.05),而18h组的受精率显著低于2min、10min、0.5h、2h及4h组(P<0.05)。2min组的受精率相比10min、0.5h、2h及4h组均无差异(P>0.05)。各组的囊胚形成率分别为82.9%、65.1%、70.5%、67.5%、75.6%、71.8%及65.2%,两两比较差异均无显著性(P>0.05)。精卵共孵育0h、2h及18h丙二醛浓度检测的均值分别为(1.06±0.21)×10-3mol/L、(1.44±0.22)×10-3mol/L及(2.00±0.21)×10-3mol/L,各组间两两比较差异均有显著性(P<0.05),丙二醛浓度随着精卵共孵育时间的缩短而降低。结论小鼠体外受精精卵共孵育时间缩短至2min不会降低受精率,同时随着孵育时间的缩短,产生的氧化应激也随之减少。

骨桥蛋白对小鼠体外受精及早期胚胎发育的影响

目的探讨骨桥蛋白(OPN)对小鼠体外受精及早期胚胎发育的影响。方法 120只昆明雌鼠和30只雄鼠,采用体外受精、胚胎培养方法,将小鼠精子、卵子、原核期胚胎和2-细胞期胚胎分别用不同浓度的OPN抗体预处理,观察小鼠受精、卵裂以及早期胚胎发育情况。结果不同浓度的OPN抗体分别预处理精子和卵子后,与对照组比较,受精率显著降低(P<0.01)。OPN抗体预处理原核期胚胎后,0.01mg/L OPN抗体组的卵裂率较对照组低,但差异无显著性(P=0.052),1.00mg/L OPN抗体组的卵裂率低于0.01mg/L组(P<0.01)及0.10mg/L组(P<0.05)。不同浓度的OPN抗体预处理2-细胞胚胎后可抑制胚胎发育。1.00mg/L OPN抗体组的4-细胞率和8-细胞率与0.10mg/L OPN抗体组相比差异无显著性(P>0.05),但前者的囊胚形成率显著低于后者(P<0.01)。1.00mg/L OPN抗体组的4-细胞率、8-细胞率以及囊胚形成率均显著低于0.01mg/L OPN抗体组(P<0.01)。结论 OPN可促进小鼠的受精和早期胚胎发育。

姜黄素对小鼠卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响

目的探讨姜黄素对小鼠卵母细胞体外成熟质量及早期胚胎发育能力的影响。方法获取小鼠卵丘卵母细胞复合体(COC),分别用含(0、5、10、15)μmol/L姜黄素的体外成熟培养液培养18 h。根据卵母细胞极体的排出计算成熟率;体外受精(IVF)后根据受精率、卵裂率、囊胚形成率及囊胚细胞数判断胚胎发育情况;线粒体荧光探针Mito-Tracker Green标记法检测线粒体在卵母细胞内的分布;实时定量PCR检测线粒体合成相关基因线粒体转录因子A(TFAM)和解偶联蛋白2(UCP2)的mRNA水平;免疫荧光细胞化学染色法检测TFAM、UCP2的蛋白表达;2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)负载法检测卵母细胞内活性氧(ROS)水平。结果卵母细胞体外成熟率和早期胚胎发育情况各组无显著性差异;姜黄素浓度与卵母细胞内线粒体成簇分布呈正相关;5μmol/L姜黄素处理组TFAM、UCP2 mRNA表达显著高于其他各组,TFAM、UCP2的蛋白表达水平与对照组相比显著升高;5μmol/L姜黄素处理组卵母细胞内ROS水平显著低于对照组。结论姜黄素处理显著改变小鼠体外成熟卵母细胞中线粒体的分布,增加线粒体合成相关基因的表达,降低卵母细胞内ROS水平,但并未对体外成熟率及早期胚胎发育能力造成显著的影响。