兔源F型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

【目的】建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,为兔巴氏杆菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列分别设计了2对引物进行双重PCR扩增,对双重PCR检测方法的退火温度和混合引物浓度进行优化,并对方法的特异性、敏感性、重复性和准确性进行验证。【结果】该双重PCR方法最优反应条件为:退火温度60℃、混合引物浓度0.8μmol·L^(−1)。该双重PCR方法能扩增出兔源F型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp)和fcbD基因片段(490 bp)、兔源A和D型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp),对兔源支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照均为阴性,无交叉反应,特异性较强。该方法对兔源F型多杀性巴氏杆菌的最低检出限为1×10^(3)拷贝·μL^(−1),敏感性高。应用该方法对90份病死兔肺脏样品进行批内和批间重复性试验,结果均一致,重复性好。应用该双重PCR方法和已报道的多重PCR方法同时检测87份已知结果的呼吸道病死兔肺脏样品,结果显示双重PCR方法检测结果和已报道的多重PCR方法检测结果与已知结果的符合率分别为97.70%和94.25%,双重PCR方法检测结果与已报道的多重PCR方法检测结果的符合率为93.10%,双重PCR方法的准确性更高。【结论】针对多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性,为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供了技术支撑。