兔出血症病毒和多杀巴氏杆菌嵌合蛋白VP60-Plp E的构建及其免疫原性鉴定

兔病毒性出血症(兔瘟)和兔巴氏杆菌病是对家兔危害最严重的两种疫病。用于防控这两种疫病的二联灭活疫苗存在着生产成本偏高问题。虽然基因工程亚单位疫苗的应用有助于提升二联苗的效力,但是生产成本依然偏高。本研究的目的是获得一种嵌合了巴氏杆菌保护性抗原PlpE的表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白。首先通过Bepipred-2.0分析,确定PlpE的免疫显性区域主要位于N端。然后将编码PlpE26-45位、51-95位氨基酸序列的基因片段连接到VP60基因的5’端和3’端,并通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得嵌合了PlpE表位的重组蛋白VP60-PlpE。血凝试验显示VP60-PlpE具有明显的血凝活性,提示重组蛋白仍然能够形成病毒样颗粒。Western blot实验结果表明VP60-PlpE与PlpE抗血清反应明显。小鼠免疫保护力实验表明VP60-PlpE对巴氏杆菌具有免疫保护力。家兔免疫保护力实验表明VP60-PlpE对兔出血症病毒和巴氏杆菌均具有免疫保护作用。总之,本研究成功构建出一种嵌合了巴氏杆菌保护性表位的兔出血症病毒VP60,为研制更低成本的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病亚单位疫苗提供了基础。

多杀性巴氏杆菌快速检测方法研究进展

多杀性巴氏杆菌(P.multocida)是一种可引起畜禽巴氏杆菌病的病原菌,其感染主要引起动物出血性败血症或传染性肺炎,给我国畜禽养殖业造成巨大的经济损失。快速、准确检测P.multocida对于畜禽巴氏杆菌病的科学防控具有重要意义。该文综述近年国内外报道的P.multocida快速检测方法,包括免疫学检测技术(酶联免疫吸附试验、间接血凝试验、免疫层析技术、免疫斑点试验、基于免疫磁珠的显色法等)和核酸检测技术(PCR及其衍生技术、多种等温扩增技术、荧光原位杂交以及基于核酸的新型检测方法等),以期为我国科学防控畜禽巴氏杆菌病提供参考方法。

福建及邻近省份禽源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

本研究收集2007-2013年福建省及邻近省份的疑似禽霍乱病死亡鸡、鸭、鹅，进行细菌分离，PCR进行种和荚膜群的鉴定，琼脂扩散试验鉴定其Heddleston氏耐热菌体抗原型。结果共分离鉴定多杀性巴氏杆菌95株，其中鸭源74株，鸡源17株，鹅源4株。其荚膜群全为A型，1型耐热菌体抗原型占67.4%。与20世纪80年代以来我国已有的报道相同，禽源（不含火鸡）多杀性巴氏杆菌血清型仍然以A：1为主。

禽多杀性巴氏杆菌与大肠杆菌科间原生质体融合的研究

以耐药标记的华农系禽多杀性巴氏杆菌５：Ａ弱毒菌株（Ｃｈｌｒ，Ｎｏｒｓ）与禽大肠杆菌Ｏ２弱毒菌株（Ｎｏｒｒ，Ｃｈｌｓ）作亲本，在ＤＮａｓｅ１始终存在的条件下，采用溶菌酶ＥＤＴＡ法制备两亲本菌株原生质体后再生，原生质体形成率均９０％以上，原生质体再生率为３５６３％、５０９３％。通过聚乙二醇钙离子促融合剂系统，进行原生质体融合，成功地获得３株具有双亲本耐药性（Ｃｈｌｒ，Ｎｏｒｒ）和双菌体血清型（５：Ａ，Ｏ２）的融合菌株。它们的生化反应、菌体和菌落大小介于两亲本菌株之间，在肉汤培养中表现出双亲菌株的生长特性。经多次传代，表明３个融合株的上述性状是稳定遗传的。

禽霍乱蜂胶灭活疫苗研制中的铁螯合剂适宜浓度确定

以含4%鸡血清的营养琼脂为培养基,进行了铁螯合剂2,2’-联吡啶对禽多杀性巴氏杆菌C48-3株的抑菌试验。结果表明,对于含4%鸡血清的营养琼脂培养基,铁螯合剂2,2’-联吡啶的合适添加量为200μmol/L。

禽多杀巴氏杆菌的交叉保护性研究

经差速和蔗糖密度梯度离心，从Ｐ１０５９感染鸡的血液中提取巴氏杆菌。每羽鸡可提取较纯的菌液约１０ｍｌ，含菌量在１００亿／ｍｌ以上。该菌液灭活后免疫鸡，用异型菌Ｃ４８１交叉攻毒，结果与肝组织苗免疫的一样，均具有５０％的保护率，而Ｐ１０５９攻毒耐过鸡则全保护。结果证明，体内繁殖的巴氏杆菌具有交叉保护性，而体外培养菌则没有。

天津地区禽多杀性巴氏杆菌分离株血清型鉴定

通过Ｃａｒｔｅｒ氏荚膜型鉴定方法和琼脂扩散试验，对天津地区禽多杀性巴氏杆菌血清型进行鉴定。结果１６株分离菌中１１株为Ａ：１（４）、４株为Ａ：１（３，４）、１株为－：１（４），表明引起天津地区禽霍乱的致病菌与国内报道的以Ａ：１型为主有一定的差异。

竹鼠多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

从红河州某竹鼠养殖场采集患病竹鼠病灶进行细菌分离培养,并对分离的菌株进行生化鉴定、动物回归试验及药敏试验。结果显示,分离的病原体为多杀性巴氏杆菌,该菌株对青霉素、诺氟沙星、阿米卡星等敏感,对链霉素、红霉素、庆大霉素、氯霉素等耐药。

羊呼吸道主要支原体和细菌病原的多重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能够同时检测绵羊肺炎支原体、丝状支原体簇成员、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌4种羊呼吸道主要病原的多重PCR方法,本研究采用各病原的特异性引物,经优化反应条件,建立了一种可以同时检测以上4种病原的多重PCR方法,并对128份临床样品进行了检测。结果显示,该方法对其它细菌和支原体扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对以上4种病原基因组DNA的检测下限分别为2.2×10~3拷贝、2.1×10~3拷贝、1.1×10~3拷贝和8.3×10~2拷贝。该方法特异性强、敏感性高,为上述4种病原的快速检测和鉴定,以及临床羊呼吸道疾病的诊断提供了一种方便、快捷和准确的工具。

福建省产毒素多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及致病性研究

为探究2019年4月引起福建省南平市某猪场的育肥猪出现鼻塞、流鼻涕、呼吸时伴有鼾声、鼻梁弯曲变形等症状的病原,本研究通过采集30份发病猪的鼻腔拭子进行细菌分离纯化、鉴定以及采用特异性PCR对分离菌分型鉴定,同时分析其致病性。结果显示,从鼻腔拭子中分离出28株多杀性巴氏杆菌(Pm),分型PCR鉴定结果显示27株分离菌为荚膜D型产毒素多杀性巴氏杆菌(T^+Pm),1株分离菌为荚膜A型Pm,表明D型T+Pm为该次致猪发病的主要病原菌;利用特异性PCR方法对Pm进行脂多糖(LPS)基因型检测,鉴定结果显示该猪群感染的Pm LPS基因型全部为L6型;致病性实验结果显示该菌株能导致二元长白猪的肺脏呈熟肉样病变,病理组织切片显示有轻度水肿,少量炎性细胞浸润,伴少量散在出血。本研究获得的T+Pm对二元长白猪具有明显的致病性,为今后深入开展T+Pm致病机理、流行病学调查和防控技术的研究奠定了基础。

野生草食动物源多杀性巴氏杆菌荚膜分型的研究

采用Carter荚膜群鉴定法对分离于我国黑鹿、白唇鹿、斑马和赤大袋鼠的56株多杀巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,结果表明:B型占78.6%(44/56),A型占14.3%(8/56),D型占3.6%(2/56),另有2株未能确定型,占3.6%(2/56)。其中荚膜B型是斑马、黑鹿和白唇鹿源多杀性巴氏杆菌的主要血清群,荚膜A型是赤大袋鼠源多杀性巴氏杆菌的主要血清群。黑鹿和白唇鹿源多杀性巴氏杆菌均存在2个血清群。

放养鸡常见细菌性疾病概述

随着我国肉鸡放养模式的迅速发展,细菌性疾病成为放养鸡的最大威胁。近年来相关研究不断深入,在疾病特征、发病规律和防治方面取得新进展,为有效防控细菌性疾病提供了新的思路。本文就放养鸡最常见的沙门氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌等病进行概述,以提高对细菌性疾病的认识,促进我国生态养鸡业的健康发展。

一株兔源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及荚膜血清分型

为确定福建某兔场呼吸道疾病病原,本试验从呼吸道病死兔的肺脏中分离到一株革兰氏阴性菌FZYH001。动物回归试验能复制出症状和病变特征与临床病例相同的病兔,且从人工感染兔的肺脏中能回收到攻毒菌FZYH001,表明分离菌FZYH001为该兔场呼吸道疾病的病原。根据分离菌的菌落形态、革兰氏染色特征、16S rRNA基因序列和荚膜血清型鉴定结果,确定为荚膜血清型为A型的多杀性巴氏杆菌。药敏试验结果表明,分离菌FZYH001仅对氟苯尼考、恩诺沙星和左氧氟沙星3种药物敏感,对氨苄西林、庆大霉素和四环素等9种药物耐药。

河北省奶牛场牛呼吸道疾病综合征病原分离鉴定

为了分离与鉴定河北省奶牛场牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)病原,自河北省张家口、秦皇岛、保定、衡水、沧州、石家庄、邯郸等地区规模化奶牛场采集奶牛呼吸道疾病临床病例鼻拭子样品及死亡奶牛的肺脏组织样品,用牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus stype 3,BPIV3)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus,BVDV)基因特异性引物进行PCR扩增,初筛阳性的样品进行病毒分离鉴定。用多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)、牛支原体(Mycoplasma bovis,MYPB)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica,Mh)基因特异性引物对所采集样品进行PCR扩增,将初筛阳性样品进行细菌分离鉴定、致病性及药物敏感试验。结果显示,分离出BVDV和IBRV,分别命名为HB-BDZ和HB-XTZ。BVDV分离毒HB-BDZ株E0基因序列与GenBank中发表的其他毒株的同源性为80.5%~99.2%,IBRV分离株HB-XTZ与GenBank其他IBRV参考株gB基因核苷酸同源性为93.8%~100%,同源性分析结果进一步表明,分离毒为BVDV和IBRV。系统发育分析结果显示,分离毒株HB-BDZ与HB-DCZ株(JX046799.1)、JL-1株(KF501393.1)、国外毒株Powder株(JN380089.1)的遗传距离较近,与国内毒株HB-DCZ株同属于Ib亚型。分离株HB-XTZ株与国内XT-IBRV(MF287966)亲缘关系最近,与BHV1.1USA株(KJ652515)和BH80株(AY745877)遗传距离相对较近,而与其他毒株遗传距离较远。利用绵羊血琼脂平板培养基和麦康凯培养基分离出Pm、Kp等2种致病菌,通过生化鉴定和PCR鉴定进一步确定分离菌为Pm、Kp。序列测定及分析结果显示,Pm分离株kmt基因与GenBank其他参考菌株核苷酸序列的同源性为96.4%~100%,与MH06873.1的亲缘关系最近。Kp分离株phoE基因核苷酸序列与GenBank其他参考菌株的同源性为96.5%~99.5%,与AF064793.1的亲缘关系最近。Pm、Kp分离菌均对小鼠具有较强的致病性。所有的分离株均表现出不同程度的耐药,Pm的分离株对环丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、阿米卡星4种抗生素敏感;Kp的分离株对氧氟沙星、阿米卡星、新霉素3种抗生素中度敏感。