三疣梭子蟹附肢再生过程中qRT-PCR内参基因的筛选与Wnt7b表达研究应用

为筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生过程中的最适内参基因,以附肢再生不同阶段的三疣梭子蟹为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对细胞骨架蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、18S rRNA(18S)、转录延伸因子基因(EF1α)、核糖体蛋白L18基因(RPL18)、细胞色素C氧化酶基因(COX)和组蛋白基因(HIS)共7个候选内参基因在肌肉、眼柄、血淋巴、肝胰腺、鳃、心脏和再生附肢共7种组织中的表达水平进行检测,并利用△Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对候选内参基因的稳定性进行评价,筛选出合适的内参,最后以最适内参基因作为参考,分析再生相关基因Wnt7b的表达水平。结果显示,在不同组织中综合稳定性最好的是RPL18,而在不同再生阶段的再生附肢中β-actin和RPL18基因做双内参基因更适合。以RPL18和β-actin作双内参基因研究Wnt7b的表达水平时发现,Wnt7b基因在三疣梭子蟹附肢再生过程中的表达呈先上升后下降再上升的趋势;Wnt7b基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,除再生附肢和血淋巴外其他组织中的表达量都较低。本研究结果为甲壳类再生发育相关研究内参基因的选择及分子调控机制研究提供了参考。

柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害,目前没有可用的有效药剂和抗病品种,分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价,针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因,构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明,使用Es Taq MasterMix对感染Candidatus Liberibacter asiaticus(C Las)的柑橘样品进行常规PCR检测时,在评价的16对引物中,OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高,推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系,部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增,F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系,且最高可稳定特异检出10^(5)倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-3) ng/μL),是灵敏度最高的引物组,OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染C Las柑橘总DNA样品(2×10^(-2) ng/μL),是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中,pnrdB83扩增效率最接近100%,且在2次重复试验中波动最小,稳定性最强,并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时,各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小,是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。

PCR在畜禽疫病诊断上的应用及研究进展

PCR技术是一门非常实用的分子生物学新技术。其特点在于敏感性强、特异性高。它在兽医临床诊断中尤其适用于那些培养困难和抗原性复杂的细菌的检测鉴定 ;诊断在基因上具有同源相似性的多重病毒感染 ;并应用于研究支原体 ,螺旋体等其它致病微生物引起的疾病。PCR技术敏感性极高 ,因此在实际操作中容易出现假阳性现象 ,同时存在产物不易纯化 ,操作步骤繁琐、耗时较多等缺陷 ,针对这些问题 ,最近出现了固相 PCR、PCR-EL ISA液相杂交技术、实时 Taq Man-PCR技术、PCR基因芯片、DNA芯片 ,这些 PCR技术新的进展有效的克服了 PCR技术的不足。随着研究的深入 ,未来PCR技术将会作为实验室常规的检测技术广泛应用于诊断病原、肿瘤细胞监测、基因表达。

聚合酶链式反应(PCR)技术研究新进展

聚合酶链式反应(PCR)在生命科学的研究领域已经得到了广泛的应用．文中对PCR技术的一些最新进展进行了简要的综述,其中包括定量PCR、纳米PCR、PCR芯片、原位PCR和免疫PCR的原理和应用．

PCR技术的新进展

PCR是用于在体外快速酶促扩增特定DNA片段的技术,本文对PCR技术的一些新方法进行了简要综述,包括易错PCR、DNA shuffilng、原位PCR、电子PCR、固相PCR和PCR芯片。

荧光定量PCR与逆转录PCR检测HCV RNA的比较分析

目的:用荧光定量PCR(FQ—PCR)和逆转录PCR(RT—PCR)法检测抗-HCV阳性血清中的HCVRNA,探讨两种方法检测结果的临床意义.方法:抗-HCV阳性血清样本1062份,其中481份用RT-PCR法检测,465份用FQ-PCR法检测,另有116份同时用两种PCR法检测.结果:RT—PCR法检测HCVRNA的阳性率为49.90%(240/481),FQ-PCR法的阳性率为62.58%(291/465),两种方法的阳性率有显著性差异(P<0.001).同时用两种方法检测116份,RT—PCR法阳性率为49.14%(57/116),FQ—PCR法阳性率为65.52%(76/116),也有显著性差异(P<0.05).FQ-PCR法检测的40份阴性中RT-PCR法检测出4例HCVRNA阳性.结论:FQ—PCR检测HCVRNA比RT-PCR特异性高,但RT—PCR的敏感性较FQ—PCR高,部分FQ—PCR检测的阴性结果不能排除HCVRNA阳性的可能性.

PCR技术在食品微生物检测中的应用研究

PCR技术因具有高灵敏度、高特异性和快速性的特点,在食品微生物检测领域广泛使用。本文阐述食品中常见的致病微生物、PCR技术的基本原理、食品中常见致病微生物的PCR检测方法,探讨PCR技术在食品微生物检测中的应用,并介绍PCR技术在食品微生物检测中的发展趋势。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

数字PCR和荧光定量PCR检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数方法的建立及其应用

传统的检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法是Southern杂交,该方法成本高、周期长,难以满足高通量检测外源基因拷贝数的育种需求,因此,本研究旨在建立快速且高通量检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。本研究从番木瓜基因组中筛选出2个单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770,以已知外源基因为单拷贝整合的转基因番木瓜为参照,利用数字PCR鉴定其拷贝数,进一步以其为内参基因,以番木瓜转基因育种常用的筛选标记基因NPTⅡ为外源目的基因,建立利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。结果表明:Cpa03g018830和Cpa03g018770均为单拷贝基因;建立的数字PCR方法对转基因番木瓜中的外源基因拷贝数的检测准确可靠,而荧光定量PCR对转基因番木瓜中外源基因单低拷贝整合的检测准确度较高,对外源基因多拷贝整合的检测准确度则较低,因此,荧光定量PCR适合用来在大量转基因植株中初筛出单低拷贝整合的植株。本研究鉴定的单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770可作为转基因番木瓜中外源基因拷贝数检测的内参基因,且建立的利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法,操作简单,速度快,适合批量检测,可为番木瓜转基因抗病育种中单低拷贝株系的选育提供新的方法。

牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×10^(7) copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9905;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL;该方法特异性良好,与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内和批间的变异系数均介于0.133%~1.81%。该方法,临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法,为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。

定量PCR与传统RT-PCR检测HCV RNA的比较研究

目的用荧光定量PCR（FQ-PCR）和逆转录PCR（RT-PCR）法检测抗-HCV阳性血清中的HCVRNA，探讨两种方法检测结果的临床意义。方法抗-HCV阳性血清样本1062份，其中481份用RT-PCR法检测，465份用FQ-PCR法检测，另有116份同时用两种PCR法检测。结果RT-PCR法检测HCV RNA的阳性率为49．90％（240／481），FQ-PCR法的阳性率为62．58％（291／465），两种方法的阳性率有显著性差异（P〈0．001）。同时用两种方法检测116份，RT-PCR法阳性率为49．14％（57／116），FQ-PCR法阳性率为65．52％（76／116），也有显著性差异（P〈0.05）。FQ-PCR法检测的40份阴性中RT-PCR法检测出4例HCVRNA阳性。结论FQ-PCR检测HCVRNA比RT-PCR特异性高．但RT-PCR的敏感性较FQ-PCR高，部分FQ-PCR检测的阴性结果不能排除HCV RNA阳性的可能性。

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。

PCR法快速检测鸭疫里氏杆菌的研究

根据Gen-Bank中25株鸭疫里氏杆菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其高度保守区设计了一对特异性引物,成功地建立了鸭疫里氏杆菌的快速、准确PCR检测方法。RA参考菌株J04(2型)、J07(JX1型)均能扩增出671bp的特异性目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌、鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性。PCR产物经EcoRI酶切鉴定得494bp和177bp两个预期条带。最低检出基因组DNA浓度为800fg。用全菌体进行PCR时,本实验室分离鉴定的60株RA均能够扩增出特异性目的条带。25份临床疑似病例的分离菌株的PCR扩增阳性率与生化鉴定率完全一致。该方法表明能从病料组织培养8h的混合菌群中快速、准确地检测到RA,可用于RA的快速诊断和流行病学调查。

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的 建立一种多重聚合酶链反应 (PCR)方法 ,对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法 采用 4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT PCR)反应 ,继用 4对 (5种 )型特异引物在单管内进行巢式PCR ,依据扩增产物的片段大小进行分型。结果 采用多重PCR ,扩增出 4 82、119、2 90及 392bp的特异片段 ,分别代表登革病毒 1～ 4型。结论 该方法快速、敏感、特异 ,有一定的推广应用价值。

4种食源性致病菌多重PCR检测体系的建立及其在乳品检测中的应用

食源性致病菌是通过食物进入人体引起食物中毒和诱发疾病的有害微生物,严重威胁着人类健康和环境安全,为了预防和控制食源性疾病的发生,有效对策之一是对食品中的病原微生物进行安全检测。本研究采用一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction,MPCR)快速检测乳品中4种食源性致病菌,结果表明,选取单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因、蜡样芽胞杆菌gyrB基因、鼠伤寒沙门氏菌invA基因、大肠埃希氏菌O157∶H7 stx2A基因的保守序列设计4对引物,在优化的PCR反应体系和退火温度58℃下,PCR扩增表现出良好的特异性,分别扩增出274、221、482、108 bp条带,无非特异性扩增,4种病原菌检出限达到10~100 CFU/mL;对17份人工染菌牛奶样品进行检测,检出结果与国标培养法完全一致。该研究结果为快速、高效、准确地检测出乳品中单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7提供了一种实用方法,也为其他食源性致病菌的快速检测提供了思路。

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。

定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用

定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量RT-PCR的原理及在植物学中的应用。

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

多子小瓜虫PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷,建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法,实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物,经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析,分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性,对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增;扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中,普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL,荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出,荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明,在临床样本和养殖水环境样本检测应用中,基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性,能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高,适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。

PCR技术研究进展

PCR(Polymerasechainreaction)在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。本文对PCR技术的最新进展作一简要综述 ,包括 :热循环仪的改进 ,引物的软件设计及网络设计 ,各种DNA聚合酶体系及其特性 ,多种PCR(MultiplexPCR) ,DNAshuffling ,PCR芯片 ,固相PCR和电子PCR(ElectronicPCR)