沉默PDCD4基因对食管癌细胞生物学特性的影响

目的探讨沉默PDCD4基因对食管癌细胞生物学特性的影响。方法选取27例食管癌患者的癌组织和对应的癌旁组织,采用荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测PDCD4表达水平,对患者5年生存率进行调查分析,并分析PDCD4表达与食管癌临床病理学特征的相关性。采用Western blot法检测食管癌细胞的PDCD4蛋白表达。利用siRNA特异沉默PDCD4基因表达。将si-PDCD4或si-NC转染到食管癌细胞TE-1中,转染稳定后,在0、24、48和72 h利用MTT法检测细胞增殖能力。用结晶紫染色法检测转染细胞克隆形成能力,用细胞划痕实验(Wounding heal)检测转染细胞迁移能力。结果 PDCD4在癌组织及癌细胞中显著低表达,PDCD4相对高表达的患者生存率高于低表达PDCD4的患者。沉默PDCD4基因能够增强食管癌细胞的增殖、克隆形成和迁移能力。结论沉默PDCD4基因促进了食管癌细胞的增殖与迁移。

RNAi沉默PDCD4基因对人喉癌Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响

目的应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,探讨其对Hep-2细胞增殖及β-catenin表达的影响。方法设计并合成针对PDCD4基因的shRNA质粒与阴性对照质粒,分别转染Hep-2细胞。实时定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后阴性对照组与干扰组PDCD4、β-catenin基因mRNA和蛋白的表达。克隆形成实验观察Hep-2细胞增殖能力的变化。结果与对照组相比,PDCD4干扰组的Hep-2细胞克隆形成率显著升高(P=0.01),PDCD4干扰组PDCD4mRNA和蛋白均显著减低(P<0.01)、β-catenin mRNA和蛋白均较对照组显著增加(P<0.01)。结论成功应用RNAi技术下调人喉癌Hep-2细胞中PDCD4基因的表达,Hep-2细胞克隆形成能力增强,β-catenin mRNA和蛋白表达显著升高。

抑癌基因Pdcd4在肾透明细胞癌中的表达及生物学意义

目的研究Pdcd4 mRNA及蛋白在肾透明细胞癌中的表达及探讨其与肾肿瘤分期分级的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应（半定量RT-PCR）及免疫组织化学方法同时检测肾脏透明细胞癌及癌旁正常组织Pdcd4 mRNA及蛋白的表达情况。结果 Pdcd4 mRNA在肾癌及癌旁正常组织中均有表达,透明细胞癌中的表达低于癌旁正常组织。肾透明细胞癌Pdcd4蛋白表达阳性率为37.5%（15/40）,显著低于癌旁正常肾脏组织阳性表达率90%（18/20）,G1~G2期Pdcd4蛋白表达阳性率为56.5%（13/23）高于G3~G4期Pdcd4蛋白表达阳性率为11.7%（2/17）,两者差异有显著性（P〈0.05）。结论 Pdcd4基因在肾透明细胞癌中呈低表达,与肾癌的发生及恶性分化程度相关,作为抑癌基因,Pdcd4蛋白表达可作为判定肾透明细胞癌生物学行为的客观指标。

PDCD4基因对T淋巴细胞亚群分化的影响

目的探讨PDCD4基因对小鼠T淋巴细胞亚群分化的影响。方法采用流式细胞术检测PDCD4基因缺失小鼠脾细胞和淋巴结细胞中的CD8+T和CD4+T,及其亚群Th1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)的特异性标记分子,并分析各细胞亚群的比例变化。结果 pdcd4-/-小鼠脾脏和淋巴结中CD8+T细胞数量较野生型C57BL/6小鼠有所下降(P<0.05),CD4+T细胞及Th1细胞也呈下降趋势,差异无统计学意义(P>0.05);而PDCD4基因缺失后Th2和Th17的分化比例无显著变化(P>0.05);进一步分析CD4+T细胞群体中CD25+Foxp3+Treg的表达,发现pdcd4-/-小鼠CD25+Foxp3+Treg比例明显上调(P<0.05)。结论 PDCD4基因能够影响部分T淋巴细胞亚群的分化,PDCD4基因敲除小鼠中CD8+T细胞数量下降和CD25+Foxp3+Treg比例升高,提示PDCD4基因有可能在免疫调节方面起到一定作用。而PDCD4基因对于CD4+T以及Th1、Th2和Th17的分化并无明显作用。

miR-21靶向调控PDCD4在四逆汤减轻大鼠心肌细胞损伤中的意义

目的探讨四逆汤含药血清在减轻大鼠心肌细胞损伤中,微小RNA-21(miR-21)靶向调控程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的意义。方法选择SD大鼠制备四逆汤含药血清,体外培养大鼠心肌细胞(H9C2),通过RNA干扰技术,转染miR-21 mimic及miR-21 inhibitor,建立稳定的miR-21 mimic和miR-21 inhibitor细胞系。细胞分别给予阿霉素(ADR)10μg/mL作用24 h损伤和无ADR处理,再各分为四个水平,分别为miR-21 mimic、miR-21 inhibitor、四逆汤+miR-21mimic、四逆汤+miR-21 inhibitor,另设正常对照组及四逆汤组,共10组。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-21、PDCD4表达,采用流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡百分率。结果与正常对照组相比,ADR+miR-21 mimic组、ADR+miR-21 inhibitor组、ADR+四逆汤+miR-21 mimic组、ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组细胞凋亡百分率、PDCD4表达量增加,而miR-21的表达量下降(P均<0.05或0.01);ADR+miR-21 mimic组相比,ADR+四逆汤+miR-21 mimic组miR-21表达上升,PDCD4下降,凋亡百分率降低(P均<0.05);与ADR+miR-21 inhibitor组相比,ADR+四逆汤+miR-21 inhibitor组细胞miR-21表达上升,PDCD4下降,凋亡百分率降低(P均<0.05)。结论四逆汤可抑制阿霉素损伤大鼠心肌细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤,其机制可能与上调miR-21的表达靶向调控PDCD4有关。

PDCD4在Hela细胞中过表达致抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调机制探讨

目的:探讨程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的抑癌机制。方法:以含有全长PDCD4的c DNA为模板,扩增PDCD4全长基因,融合PDCD4-GFP融合基因真核表达载体,将其转染Hela细胞,采用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,以荧光定量PCR和Western-blot检测PDCD4在细胞内的表达以及抗凋亡基因Bcl-2的表达情况。结果:经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实融合基因真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内PDCD4-GFP融合蛋白的表达;RT-PCR证实经PDCD4基因转染的细胞内PDCD4 mRNA表达增高。PDCD4的过表达能够导致Bcl-2基因表达下调。结论:PDCD4基因表达于宫颈癌细胞核和胞浆内,并且PDCD4能够抑制Bcl-2基因的表达水平。

miRNA-21-5p通过pdcd4靶向调控胃癌细胞对顺铂敏感性的机制研究

目的:探究微小RNA-21-5p(miRNA-21-5p)通过下调pdcd4基因表达调控胃癌耐药细胞系SGC-7901/DDP对顺铂敏感性机制的研究。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度的顺铂(0、1、2、4、8、16、32μmol/L)对胃癌细胞系SGC7901及胃癌耐药细胞系SGC7901/DDP增殖抑制的影响。通过实时荧光定量PCR检测SGC7901/DDP细胞中瞬时转染miRNA-21-5p inhibitors后miRNA-21-5p相对表达量的变化。采用Western blot及实时荧光定量PCR检测转染组、无关序列转染组(NC组)及空白转染组(CON组)分别转染miRNA-21-5p inhibitors及无关序列后对靶基因pdcd4蛋白及mRNA表达量的影响。结果:MTT实验结果显示耐药细胞SGC7901/DDP相对于亲本细胞SGC7901对顺铂不敏感(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,转染组miRNA-21-5p表达量均明显低于NC组和CON组(P<0.01),转染组pdcd4 mRNA表达量均明显高于NC组和CON组(P<0.01)。Western blot检测结果示,转染组pdcd4蛋白表达量均明显高于NC组和CON组(P<0.01)。结论:miRNA-21-5p表达水平的升高在一定程度上有利于胃癌细胞增殖,并通过下调pdcd4的表达,降低胃癌细胞对顺铂的敏感性。

CRP基因沉默后心肌细胞系H9c2的miR-21及其靶基因表达、细胞活力观察

目的观察沉默炎症因子CRP基因对H9c2心肌细胞活力的影响,并探讨其机制。方法 (1)取H9c2心肌细胞,随机分为CRP沉默组和对照组。CRP沉默组转染对CRP特异性沉默的p LV-shRNA-CRP慢病毒,对照组转染无敲减作用的p LV-shRNA-Scramble慢病毒。筛选与鉴定慢病毒载体成功转染H9c2心肌细胞。转染48 h后,采用实时定量PCR法观察两组H9c2心肌细胞CRP基因的沉默效率、miR-21及PDCD4、PTEN、Spry1 mRNA。(2)取H9c2心肌细胞,随机分为空白组、对照组和CRP沉默组,空白组不转染病毒加入等量的DMEM培养基,对照组转染p LV-shRNA-Scramble慢病毒颗粒,CRP沉默组转染p LV-shRNA-CRP慢病毒颗粒。转染24 h后,采用MTT法检测三组H9c2心肌细胞活力。结果 (1)CRP沉默组和对照组H9c2心肌细胞中CRP mRNA相对表达量分别为0. 320±0. 069、1±0. 090,miR-21相对表达量分别为0. 740±0. 099、0. 280±0. 010,两组相比P均<0. 01。CRP沉默组PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表达均低于对照组(P均<0. 01)。(2)CRP沉默组、对照组和空白组细胞活力分别为0. 78±0. 030、0. 66±0. 010、1. 00±0. 013;与空白组相比,CRP沉默组和对照组细胞活力均下降(P均<0. 01);与对照组相比,CRP沉默组细胞活力上升(P <0. 05)。结论沉默CRP基因可促进H9c2心肌细胞存活,这可能与其可增加H9c2心肌细胞中miR-21表达,抑制PDCD4、PTEN和Spry1的基因表达有关。

PDCD4转染卵巢癌细胞系基因表达谱的变化

目的探讨卵巢癌细胞系SKOV3稳定表达程序性细胞死亡4(PDCD4)基因后基因表达谱的变化。方法将pDsRed2-N1-PDCD4真核表达载体和pDsRed2-N1空载体分别转染至SKOV3并获得稳定细胞系,应用基因芯片技术分析PDCD4基因转染后基因表达的变化,RT-PCR检测基因的表达以验证芯片结果。结果PDCD4转染SKOV3后引起大量基因表达的变化,表达明显差异基因共有467个,其中上调255个,下调212个;RT-PCR验证选取的5个基因的表达差异和芯片显示的结果一致。结论成功筛选出PDCD4基因转染卵巢癌细胞系SKOV3后的差异表达基因,为进一步研究PDCD4的抑癌作用机制提供了实验依据。