微生物蛋白激发子PeaT1的获得及诱导水稻抗旱性的初步研究

PeaT1是来源于极细链格胞菌(Alternaria tenuissima)的一种蛋白激发子,具有促进植物生长和提高抗逆性的功能。为了进一步研究该激发子的功能,构建了表达该蛋白质的原核表达载体pET28a-peaT1,诱导表达获得大量目的蛋白质。利用AKTA蛋白质纯化系统,通过亲和层析、离子交换层析和分子筛等纯化技术,获得高纯度的PeaT1蛋白。用不同浓度的纯化蛋白处理水稻,进行抗旱性检测,结果表明PeaT1可明显提高水稻的抗旱性。

极细链格孢菌蛋白激发子Peat1在酵母双杂交系统中转录激活活性检测

以PCR法从pGEX-6p-1-peaT1中扩增出peaT1基因片段,电泳回收后将peaT1基因定向克隆到plexA载体中。将诱饵载体plexA-peaT1经酶切和测序鉴定后,用PEG/LiAC法转化酵母EGY48[p8op-lacZ],并进行诱饵载体转录激活活性检测。结果表明,重组质粒经EcoR I和XhoⅠ双酶切后,琼脂糖凝胶电泳检测可见2条与预期相符的条带,表明诱饵载体构建成功。β-半乳糖苷酶活性分析表明,诱饵载体plexA-peat1无转录激活活性,对酵母菌株也无毒害作用。该诱饵载体可用于酵母双杂交系统中,为下一步筛选cDNA文库奠定了基础。

蛋白激发子PeaT1的高密度发酵及生理功能检测

PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中提取出的一种植物蛋白激发子,具有促进植物生长,增强作物抗逆性的功能。由于该蛋白具有无残留、无毒副作用的优点,因此具有发展为生物农药的应用前景。在100L发酵罐中利用分批补料技术对PeaT1工程菌进行高密度发酵,通过AKTA蛋白纯化仪对发酵产物进行了亲和纯化,并检测了纯化所得蛋白对水稻在15℃低温下生长的影响。发酵最终菌体密度达80g/L,每升菌液纯化得到蛋白90mg,纯化所得蛋白能够促进水稻低温下的生长,具有激发子活性。

蛋白激发子基因peaT1植物表达载体的构建及其转化棉花的研究

[目的]构建蛋白激发子基因peaT1的植物表达载体并转化棉花品种‘CCRI24’。[方法]设计含有PstⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以质粒pET28a-peaT1为模板扩增得到peaT1序列,将其通过中间载体pG4AS-cup克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,通过农杆菌介导法转化棉花品种‘CCRI24’,诱导并筛选抗性愈伤和胚性愈伤,通过PCRs、outhern杂交和RT-PCR检测筛选的棉株。[结果]构建了含有增强子和多联终止子的植物表达载体pCAMBIA2300-peaT1,获得了大量的胚状体和4棵再生苗并嫁接成活,验证了蛋白激发子基因peaT1已经整合到再生苗2和4基因组当中。[结论]本研究为进一步开展蛋白激发子基因peaT1转化棉花的研究提供了基础材料。

蛋白激发子基因peaT1转基因棉花的获得及初步鉴定

将来源于极细链格孢菌的蛋白激发子基因peaT1克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,成功构建了含有增强子和多联终止子的植物表达载体pCAMBIA2300-G4AS-peaT1。通过花粉管通道法转化棉花,经卡那霉素抗性筛选、PCR和RT-PCR检测获得一株转基因棉花植株,其植株茎粗和成铃数均高于非转基因对照株。

极细链格孢菌蛋白激发子PeaT1在酵母双杂交系统中转录激活活性的检测（英文）

2000年笔者从植物病原真菌中提取获得一类新型蛋白激发子，它能提高植物自身免疫力，促进植物生长，提高作物产量和产品品质。并在研究该类蛋白的过程中，从极细链格孢菌中分离纯化到1种能诱导植物产生系统抗性、促进植物生长的蛋白，并进一步克隆了编码该蛋白的基因peaTl（Genbank登录号CH445335）。为进一步阐明PeaTl的分子作用机理，拟采用酵母双杂交技术，

激发子基因peaT1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有激发子基因peaT1的植物表达载体pCAM-BIA2300-G4AS-peaT1转化三生烟,获得了转基因烟草植株。用PCR检测确认了阳性转化株,用Southern杂交、RT-PCR和Western杂交进一步证实了peaT1基因的整合、转录和表达。对T1代转基因阳性株进行TMV接种试验,结果显示,与非转基因对照相比,表达peaT1的烟草叶片枯斑数量减少,表明蛋白激发子基因peaT1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。

Peat1蛋白及其3个缺失突变体的表达与热稳定性分析

[目的]为揭示Peat1蛋白序列(含1个NAC结构域和1个UBA结构域)各片段在该蛋白热稳定性上的作用。[方法]构建了Peat1蛋白及其3个缺失突变体的融合表达载体,经IPTG诱导表达的目标蛋白,对所得蛋白经AKTA亲和纯化和热稳定性分析。[结果]与Peat1一样,3个缺失突变体蛋白(Peat1、Peat1-△CD99、Peat1-△ND49和Peat1-△ND108)都具有良好的热稳定性。[结论]说明NAC或UBA结构域对Peat1蛋白的热稳定性不是同时必需的,可能它们都有单独赋予蛋白某种特殊稳定结构的作用。

极细链格孢菌peaT1基因在毕赤酵母中的表达与功能分析

建立了在毕赤酵母(Pichiapastoris)中分泌表达PeaT1蛋白的技术。将来源于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的基因peaT1亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建了重组表达载体pPIC9K-peaT1,分别用SalI或BglII酶切线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株中,经MD平板筛选、PCR鉴定获得整合有外源基因的重组菌株。在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,PeaT1在酵母中大量表达并分泌到胞外,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的表观分子量约为35kD。表达蛋白上清稀释液能诱导烟草产生对TMV的抗性,其枯斑数抑制率可达到30.37%。每升表达上清液经超滤浓缩和离子交换层析可纯化目的蛋白16.13mg,该纯化蛋白能显著地促进小麦幼苗的生长。

激活蛋白PeaT1在烟草细胞膜上的结合位点及其特性

激活蛋白PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离的,能诱导植物产生系统获得抗性的蛋白激发子。为了阐明PeaT1诱导植物提高抗性的分子机制,本文采用RT-PCR技术研究了PeaT1诱导烟草悬浮细胞后不同时间PR-1a基因的转录活性,在烟草悬浮细胞中加入20μg/mL的PeaT18h后,PR-1a基因转录活性达到最高;相同浓度的PeaT1处理烟草植株,烟草叶片中酸性PR蛋白表达量升高。激光共聚焦显微镜观察到FITC荧光素标记的PeaT1可与烟草悬浮细胞表面结合;免疫荧光法进一步证明PeaT1可与烟草细胞质膜结合;使用共价交联剂BS3证明125I-PeaT1可与烟草细胞质膜上的2个分子结合,而与加热或蛋白酶处理的质膜不能发生交联,说明与PeaT1结合的分子具有蛋白特性,分子量分别为20kDa和30kDa。上述实验结果证明在烟草细胞质膜上存在着激发子PeaT1受体样的结合位点。

激活蛋白PeaT1诱导烟草对TMV的系统抗性

枯斑三生烟草(Samsun-NN)经激活蛋白PeaT1诱导后接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),对TMV产生了明显的系统获得抗性,枯斑抑制率达54.15%,枯斑大小也受到一定程度的限制。研究结果表明,PeaT1处理烟草植株下位三片叶不同时间后,其上部叶片中PPO、POD和PAL 3种抗病防御酶活性均比对照提高,第4 d酶活性达到最高值。实时荧光定量PCR检测结果显示,经PeaT1诱导4 d后烟草叶片中抗病相关基因PR1a、PR1b、NPR1在转录表达水平上较未诱导对照都有不同程度的上调。由以上结果我们推测PeaT1诱导烟草产生了系统获得抗性,本研究为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的信号传导途径奠定了基础。

Stable isotope labelled mass spectrometry for quantification of the relative abundances for expressed proteins induced by PeaT1

The protein elicitor from the mycelium of Alternaria tenuissima has been isolated.The elicitor triggered resistance to the tobacco mosaic virus in tobacco by inducing relative oxygen species,but without causing hypersensitive necrosis.The elicitor is reported to impart resistance against Verticillium dahliae and to increase yield in cotton,but its mechanism is not yet clear.In this study,the stable isotope labelled mass spectrometry method was used to quantify the relative abundances of protein expression induced by PeaT1 in Arabidopsis.A significant difference in the relative abundances for the expression of different proteins related to metabolism,modification,regulatory,defense,stress and antioxidation was found in Arabidopsis.