PEG10基因在不同转移潜能肝癌细胞中表达的定量分析

目的通过对不同转移潜能的肝癌细胞株中PEG10基因(parternal express gene 10)表达水平的定量分析,探讨其作为肝癌转移基因的可能性。方法提取肝癌细胞株HepG2、MHCC-97L、MHCC-97H的RNA,反转录合成第一链cDNA,对反转录产物进行荧光定量PCR。用管家基因-βactin的cDNA起始浓度作为参照标化PEG10的cDNA起始浓度,对标化结果进行方差分析。结果HepG2、MHCC-97L、MHCC-97H标化后的PEG10 cDNA相对起始浓度分别为(3.15±0.05)×10-3(、5.06±0.03)×10-3(、6.14±0.09)×10-3,各肝癌细胞系之间PEG10表达量差异也存在极显著性意义(P<0.01)。结论PEG10基因表达水平与肝癌细胞的转移潜能呈正相关,可以推测PEG10基因可能是促使肝癌转移的癌基因。

PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响.方法:设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡.结果:成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体.它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率最高,可达93.99%.HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P<0.05),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率最高,为66.91%.结论:靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.

Peg10基因在黏着斑激酶介导的肝癌细胞耐药中的作用

目的初步探讨Peg10基因与黏着斑激酶(FAK)介导的肝癌细胞耐药(CAM-DR)的关系及分子机制。方法采用MTT法检测5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(ADR)对LO2细胞、ADR耐药的人肝癌细胞BEL-7404/ADR(7404/ADR)和Peg10基因沉默的siRNA-BEL-7404/ADR(siRNA-7404/ADR)细胞增殖的影响;建立7404/ADR和siRNA-7404/ADR裸鼠荷瘤模型,48只裸鼠随机分为6组,每组8只,A、C、D组注射7404/ADR细胞,B、E、F组注射siRNA-7404/ADR细胞;A、B组尾静脉注射生理盐水,C、E组给予5-Fu,D、F组给予尾静脉注射ADR,测量瘤块体积,RT-PCR检测Peg10基因的表达,Western Blot法检测PEG10、p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白的表达。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果 ADR和5-Fu对siRNA-7404/ADR 24 h的IC50值均较7404/ADR的降低,差异均具有统计学意义(t值分别为7.641,7.560,P值均<0.01)。B、C、D组肿瘤体积较A组小,差异均有统计学意义(P值均<0.05),E、F组肿瘤体积较B组小,差异均具有统计学意义(P值均<0.01);E组与C组比较,F组与D组的肿瘤体积差异亦均有统计学意义(P值均<0.05)。B、E、F组Peg10的mRNA极少表达,C、D组Peg10的mRNA表达较A组有所降低。B组PEG10蛋白极少表达,与A组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),其pFAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白表达与A组比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。C、D组PEG10、p-FAK、pJNK、p-ERK和p38MAPK蛋白的表达较A组均降低,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。E、F组p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白表达与B组比较,差异均有统计学意义(P值均<0.01),而C组与E组、D组与F组相比,PEG10、p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白的表达差异亦均有统计学意义(P值均<0.01)。结论 Peg10基因失活后可增加ADR耐药的BEL-7404细胞株对5-Fu和ADR的敏感性,其作用机制可能与其下调p-FAK、p-JNK、p-ERK和p38MAPK蛋白的表达有关。

PEG10基因在肝癌组织中高表达的分子机制及其功能的研究

目的:探讨印迹基因父系表达基因10(paternally expressed gene10,PEG10)在肝癌组织中高表达的分子机制,及其对肝癌细胞生长的影响。方法:采用半定量RT-PCR法检测30例肝癌患者术后肝癌和癌旁组织中以及15株肝癌细胞株中PEG10基因的表达水平;甲基化特异PCR(methylation specific PCR,MSP)技术检测17例PEG10基因高表达的肝癌和癌旁组织中PEG10基因启动子区域CpG岛甲基化状态的差异,及其与PEG10基因表达水平的关系。采用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术沉默肝癌QGY-7703细胞中PEG10基因的表达,并观察对细胞克隆形成能力的影响。结果:与癌旁组织相比,PEG10基因在67%(20/30)的肝癌组织中表达水平明显提高,在15株肝癌细胞株中均有表达。PEG10基因CpG岛2在29.4%(5/17)肝癌组织中显示有肝癌特异性低甲基化,同时采用亚硫酸氢盐测序验证了PEG10基因CpG岛2在肝癌病例中总体低甲基化的状态。与对照组相比,短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰PEG10表达后,肝癌细胞株QGY-7703的克隆数目明显减少(P<0.05)。结论:印迹相关基因PEG10在肝癌中高表达,可能与其启动子区域CpG岛2的低甲基化密切相关,沉默PEG10表达可以抑制肝癌细胞的生长,提示PEG10基因可能是一个新的肝癌治疗的药物靶点。

PEG10对人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞增殖和凋亡影响的初步研究

目的初步研究父系表达印记基因PEG10低表达对人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞增殖和凋亡的影响。方法构建4组PEG10干扰载体[si-898、si-1854、si-1951及对照(si-NC)],然后转染到HTR-8/Svneo细胞株并进体外培养,si-NC组为对照组。流式细胞术检测HTR-8/Svneo细胞的细胞周期和细胞凋亡,qRT-PCR检测Cytochrome C、Caspase3、Bid、Bak、Bax及Cyclin D1 mRNA的表达情况,MTT法检测细胞增殖活力。结果与对照组比较,转染3组siRNA片段均能显著抑制PEG10基因的表达(P<0.05),其中si-898、si-1854抑制作用更显著(P<0.01)。转染si-898或si-1854的HTR-8/Svneo细胞Cytochrome C、Caspase3、Bid、Bak、Bax mRNA的表达显著升高(P<0.01),而Cyclin D1 mRNA的表达显著降低(P<0.05),并且细胞凋亡率也显著高于对照组(P<0.05)。MTT法检测细胞增殖活力显示,与对照组相比,干扰PEG10基因后细胞在48 h和72 h的增殖活力也显著降低(P<0.05)。流式细胞术检测显示,干扰PEG10基因后细胞周期阻滞在G1期。结论干扰PEG10基因能诱导人类绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞凋亡,降低细胞增殖活力,阻止细胞周期从G1期到S期的转化进程,导致细胞周期阻滞。

FGR的胎盘组织印记基因PEG10DNA甲基化水平及其意义

目的通过检测父方表达印记基因PEG10 DNA在胎儿生长受限(FGR)患者胎盘组织甲基化水平,探索FGR是否与其胎盘中印记基因的甲基化程度相关。方法采用前瞻性研究,收集2014年1月至2017年1月在上海市第一人民医院宝山分院妇产科住院分娩的FGR者56例(研究组)和同期正常单胎晚孕分娩者56例(对照组),采用亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测研究组和对照组胎盘组织的PEG10 DNA甲基化水平,分析其甲基化水平与FGR的临床病理关系。结果 FGR胎盘组织印记基因PEG10表现为异常甲基化水平,与对照组相比,研究组胎盘组织印记基因PEG10 DNA甲基化水平在CPG岛1无明显差异,而在CPG岛2及CPG岛3明显高于对照组(t值分别为94.97,7.16,均P<0.05),尤其以CPG岛2最为明显(研究组表达为0.544±0.027,对照组表达为0.152±0.015)。结论胎盘组织父方表达的印记基因的DNA甲基化水平可能是导致FGR发病的原因之一。

MiR-122调控肝癌遗传印记基因PEG10的实验研究

目的探讨遗传印记基因PEG10功能的异常与miRNA失调控的相关性。方法通过生物信息学网站TargetScan预测可能参与PEG10调控的miRNA分子，筛选到miR～122。通过基于taqman探针的实时定量逆转录聚合酶链反应，比较miR-122在原代正常肝细胞和3株肝癌细胞株（Huh7，Hep3B，HepG2）中的表达差异。将miR-122的分子前体转染HepG2细胞，观察转染前后PEG10在mRNA和蛋白水平的表达变化。多组均数间比较采用秩和检验，配对样本组间差异比较采用t检验。结果生物信息学预测结果显示，miR-122可能参与了PEG10的调控。实时定量逆转录聚合酶链反应结果显示，PHHC，Huh7、HepG2、Hep3B细胞miR-122的表达量（2^△ △ Ct值）分别为1．0578±0．0975、0．5600±0．0632、0．0068±0．0012、0．0058±0．0008，H=9．667，P〈0．05。与原代正常肝细胞相比，miR-122在肝癌细胞株中表现为完全（Hep3B、HepG2细胞）或部分缺失（Huh7细胞），其表达水平与PEG10呈负相关。将miR-122分子前体转入HepG2细胞后，PEG10在mRNA水平并未显示出明显的下调，但Western blot结果提示miR-122分子前体明显抑制了PEG10蛋白的表达。结论miR-122参与了遗传印记基因PEG10的调控，其调控主要发生在翻译阶段，即蛋白质水平。miRNA的失调控与肝癌的发生密切相关，其功能的异常可能早于受其调控的癌基因或抑癌基因的改变，是肝癌发生的早期事件，这为肝癌的早期预警和基因治疗提供了新思路。

PEG10在不明原因复发性流产患者绒毛组织及配偶精子中的甲基化状态及表达情况

目的研究不明原因复发性流产(URSA)绒毛组织与配偶精子PEG10的甲基化水平及其蛋白和mRNA表达情况。方法收集2014年1月-2016年10月在广东医科大学附属医院生殖中心就诊的URSA患者100例为G2组,其配偶100例为G4组;早期妊娠自愿人工流产者100例为G1组,其配偶100例为G3组。免疫组化法及蛋白免疫印迹法检测PEG10印记基因的蛋白水平,RT-PCR法检测PEG10 mRNA水平。在所有队列中严格匹配URSA患者及配偶和早期妊娠自愿人工流产患者及配偶各3例,包括6份绒毛样本及6份精液样本行甲基化芯片检测PEG10的甲基化水平。结果 PEG10基因的DMR区平均甲基化水平在URSA绒毛组织和早期妊娠自愿人工流产绒毛组织间比较,差异有统计学意义(P<0.05);PEG10基因的DMR区平均甲基化水平在URSA患者配偶精子和早期妊娠自愿人工流产患者配偶精子间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示,PEG10在URSA绒毛组织的表达水平与早期妊娠自愿人工流产绒毛组织比较表达较弱。蛋白免疫印迹法结果显示,PEG10蛋白在URSA绒毛组织中的表达水平与早期妊娠自愿人工流产绒毛组织比较明显降低(P<0.001)。RT-PCR法结果显示,PEG10mRNA在URSA绒毛组织中的表达水平与早期妊娠自愿人工流产绒毛组织比较明显降低(P<0.001)。结论父本印记基因PEG10与胚胎早期的发育有相关性,其低表达是URSA的可能原因之一,通过检测精子PEG10的甲基化水平不能推断早期胚胎发育的情况。