虾过敏原Pen a1抗原表位的关键氨基酸分析

建立了一种利用表位抗体筛选虾过敏原Pen a1抗原表位中关键氨基酸的方法。利用生物信息学软件MEGA5计算Pen a1中表位的氨基酸组成和出现频率,并采用DNAMAN软件对SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白的氨基酸保守性分析,综合两种方法筛选出各表位可能的关键氨基酸,Epitope 1:K,E,N;Epitope2:K,L,E;Epitope 3:E,R,D,L,Q;Epitope 5:K,L,Q。用丙氨酸取代并合成突变多肽。利用表位抗体,通过竞争性免疫斑点法及间接ELISA方法检测突变多肽的抗体结合能力,筛选出各表位的关键氨基酸。分别为:Epitope1:谷氨酰胺;Epitope2:亮氨酸和谷氨酸;Epitope3:亮氨酸和天冬氨酸;Epitope5:亮氨酸。实验结果证明了此种筛选关键氨基酸的方法的可行性,为Pen a1致敏机理的研究及利用基因修饰脱敏提供了一定的理论依据。

Pen a1抗原表位187—202关键氨基酸的筛选和鉴定

【目的】Pen a1是虾中主要的过敏原蛋白,其抗原表位与致敏作用有关。对Pen a1的一个抗原表位187—202中氨基酸的出现频率及保守性进行分析后合成突变肽,并检测该突变肽与表位抗体的结合能力,筛选关键氨基酸,为研究虾致敏机理及脱敏方法提供理论依据。【方法】利用MEGA5软件对Pen a1蛋白5个表位及其氨基酸的组成与出现频率进行分析,选出这些表位中出现频率大的氨基酸;对过敏原数据库中所有致敏食物原肌球蛋白的氨基酸序列的保守性进行分析,筛选出保守性高的氨基酸。两种方法筛选出的共有氨基酸为潜在的关键氨基酸。用丙氨酸分别替代这些潜在的氨基酸形成突变肽。利用固相合成法分别合成原表位肽及突变肽。并将原表位肽作为免疫原免疫新西兰大白兔,获得表位多克隆抗体。利用间接ELISA方法及竞争性Dot-blot方法检测突变的表位肽与表位抗体IgE结合能力,筛选出结合能力明显下降的突变肽,其中替换的氨基酸即为该表位的关键氨基酸。【结果】谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)在表位中出现频率较大,并高于在Pen a1整体蛋白中出现的概率,为活性氨基酸。将序列在187—202的表位中氨基酸组成及出现频率进行统计,推测E、V、L可能为该表位的关键氨基酸。将SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白序列与Pen a1氨基酸序列用DNAMAN软件进行多序列比对,K、L、E、V、G在所有比对的序列中都存在,表明这5个氨基酸为保守氨基酸。选择共有的E、V、L为可能的关键氨基酸,用丙氨酸替代表位中E、V、L分别合成1、2和3号突变肽。用竞争性Dot-blot检测突变肽结合抗体能力,以提取纯化的虾致敏蛋白为包被原,用突变肽抑制虾蛋白结合抗体,发现原表位肽抑制作用明显,1号突变肽的抑制作用与原表位肽相似,2、3号肽的抑制作用明显低于原表位肽。谷氨酸突变的1号突变肽对表位活性并没有较大影响,说明谷氨酸不是该表位的关键氨基酸;而2、3号突变肽与抗体的结合能力明显降低,即亮氨酸和缬氨酸是该表位的关键氨基酸。同时,利用间接ELISA方法,将原表位肽和突变肽与兔血清反应,比较OD450值。结果显示,1号突变肽致敏性降低,OD450值约为对照的1/2.1,2号突变肽OD450值降低为对照的1/2.6,3号突变肽OD450值降低为对照的1/3.2。说明突变表位与表位抗体结合能力均有不同程度的降低。结合竞争Dot-blot试验结果,亮氨酸和缬氨酸为该抗原表位的关键氨基酸。【结论】建立了一种关键氨基酸的筛选和鉴定的方法。亮氨酸和缬氨酸被丙氨酸取代后,其与表位对应抗体的结合能力发生明显下降,是Pen a1中表位187—202的关键氨基酸。这种筛选关键氨基酸的方法可以用于其它抗原表位的关键氨基酸的确定及氨基酸对表位致敏性的影响,深入研究过敏原脱敏机理;同时也可用于基因工程或氨基酸修饰中降低过敏原致敏性。

模拟肠液对Pen a1及其抗原表位免疫原性的影响

体外模拟人体肠液(SIF)消化分析Pen a1消化后免疫原性的变化规律。虾致敏蛋白Pen a1及其表位多肽经SIF消化后,用全抗体和表位特异性抗体检测Pen a1及其各抗原表位的免疫原性的变化,并测定表位多肽的SIF消化稳定性。结果表明,Pen a1的免疫原性在消化60 min内下降显著,在90 min后下降缓慢,生成的新片段仍具有免疫原性,但会逐步完全分解至SDS-PAGE无法检测出;Pen a1中5个抗原表位的免疫原性变化也类似。Western-blot表明五个表位抗体与生成的新蛋白结合程度不同,No.3、4、5抗体与20~30 ku处的新蛋白片段结合多于No.1、2。ELISA检测表明即使经过4 h的消化,免疫原性也只是降低了80%。Pen a1各表位消化稳定性为No.2>No.1>No.3>No.4>No.5;5个表位多肽的消化稳定性为No.3>No.1>No.4>No.2>No.5,与各表位上的酶切位点的个数呈负相关。可以得出Pen a1中No.2表位具有最高的消化稳定性,No.5表位表消化稳定性最差。

原肌球蛋白的重组表达、鉴定及与免疫球蛋白E结合能力分析

目的:在大肠杆菌中重组表达贝类主要过敏原—原肌球蛋白(Pen a 1),并且评估其IgE结合活性。方法:首先基于Pen a 1的已知序列人工合成Pen a 1基因,其次将其与质粒pET-28a连接以构建重组表达质粒pET-28a(+)-Pen a 1,经测序、酶切鉴定后导入表达宿主E.coli BL21(DE3)细胞中。通过IPTG诱导,重组表达Pen a 1蛋白,镍柱纯化表达产物,并采用SDS-PAGE电泳及质谱技术鉴定所得重组蛋白。最后应用贝类过敏患者采用LICA技术检测该重组蛋白的IgE结合活性。结果:PCR结果表明,目的基因全长为930 bp,与理论预测值一致。SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白在宿主菌内以可溶性蛋白的形式高效表达,分子量约为36 kD,大小与理论值相符。质谱鉴定结果进一步说明所得的重组蛋白为原肌球蛋白Pen a 1。免疫分析结果表明该蛋白具有较高的IgE结合能力。结论:成功表达、纯化出有良好免疫学活性的重组原肌球蛋白Pen a 1,为进一步研究Pen a 1在贝类动物如虾类过敏的诊断和治疗中作用奠定基础。