扩展青霉碱性脂肪酶cDNA的克隆和表达

采用 ＴＲＩｚｏｌ试剂一步法所抽提的总 ＲＮＡ的 Ｄ（２６０）／Ｄ（２８０）值为 １.８２，甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的 ２８Ｓ ｒＲＮＡ和 １８Ｓ ｒＲＮＡ 条带．根据扩展青霉所产碱性脂肪酶（Ｌｉｐ ＰＥ）Ｎ末端 ２０个氨基酸残基序列和真核生物 ｍＲＮＡ３’端具有 ｐｏｌｙ（Ａ）等所提供的生物信息，采用 ＲＴ－ＰＣＲ技术和 ３’－ＲＡＣＥ法扩增了 ＬｉｐＰＥ成熟肽编码区和３’非纪码区的ｃＤＮＡ，直接将该ＰＣＲ产物克隆至ｐＵＣｍ－Ｔ载体中。序列分析表明，该碱性脂肪酶含有２５８个氨基酸，其中保守的五肽序列为 Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ。进一步采用 ＣｌｏｎＴｅｃｈ公司的 ＳＭＡＲＴ～（ＴＭ）ＰＣＲ ｃＤＮＡ文库构建试剂盒，扩增、克隆和测定了自转录起始点至纪码区的 ｃＤＮＡ片段，从而完成了 Ｌｉｐ ＥＰ完整 ｃＤＮＡ的分析测定．最后将编码完整脂肪酶蛋白的ｃＤＮＡ克隆至 ｐＧＥＸ－５Ｘ－３表达载体中．在大肠杆菌 ＢＬ２１中进行 ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明，所表达的 ＧＳＴ－Ｌｉｐ ＥＰ融合蛋白分子质量约为 ５３ｋｕ；