鹅源草酸青霉CBHⅠ基因克隆及真核表达载体构建

【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie & Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU574736)、5′端序列B1(EU603295)、3′端序列B2(EU652768)及全长基因C(EU727171),并成功构建真核表达载体pPIC9K-CBHⅠ;生物信息学分析表明,该基因蛋白序列与微紫青霉氨基酸序列同源性最高,达76%,前26个氨基酸为信号肽序列,疏水性可达2.63,由催化功能域、衔接区和真菌性纤维素结合域构成,其三级结构主要为β-sheet。【结论】鹅源草酸青霉纤维素酶CBHⅠ基因全长序列的克隆进一步丰富了丝状真菌的生物信息学资源;其真核表达载体的构建为将该菌株进一步在真核宿主中表达,从而获得高效工程菌株奠定了基础。

鹅源草酸青霉产果胶酶的发酵条件研究

为了确定鹅源草酸青霉产果胶酶发酵的最佳培养基组成及发酵条件,以鹅源草酸青霉为研究菌株,通过聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)、果胶酯酶(PE)的测定,研究了培养基组成(碳源、氮源、无机盐)及不同发酵条件(接种量、温度、pH和发酵时间)对草酸青霉产果胶酶活力的影响,并通过L9(34)正交试验确定草酸青霉发酵生产果胶酶不同组分的最佳培养基组成。结果表明:(1)以葡萄糖为碳源可以诱导PG、PL、PE产生(p<0.001),每15g基础培养基中葡萄糖的最适添加量分别为:1.2g,1.5g,1.5g;(NH4)2SO4对PG、PE、PL产生有明显刺激作用(p<0.001),每15g基础培养基适宜添加量分别为:0.6g,1.5g,0.3g;磷酸二氢钾(KH2PO4)对PG活力有明显的提高作用(p<0.001),MgSO4和KH2PO3对PL有极显著影响(p<0.001)。(2)PG、PL、PE最佳接种量每15g分别1.5mL、2mL和1.5mL培养基装量,最佳培养温度分别为32,30,32℃,培养基最佳初始pH值分别为5.0,4.0,4.5;最佳发酵时间分别为60h,72h和84h。

鹅源草酸青霉溶磷效果及对鹅磷代谢的影响

本试验以解磷巨大芽孢杆菌为对照,在以骨粉、CaHPO4、Ca3（PO4）2为磷源的培养基中,对青霉菌F17、F67的溶磷效果进行了研究;同时以鹅为试验动物,采用全收粪法进行了代谢试验,研究了日粮中添加不同水平草酸青霉菌液（0.1%、0.3%、0.5%）对Ca、P的消化吸收的影响。结果表明：①在以骨粉、CaHPO4、Ca3（PO4）2为磷源的固体培养基和液体培养基中,青霉菌F67组的溶磷圈直径极显著大于F17和对照菌株组（P〈0.01）,F67组的溶磷量极显著高于F17和对照菌株组的溶磷量（P〈0.01）。②在营养水平一致的条件下,随着草酸青霉菌液添加水平的提高,体内P的表观消化率为49.86%-59.78%,Ca的表观消化率为47.65%-58.25%,Ca、P表观消化率在草酸青霉发酵液添加比例为0.3%时最高,与对照组差异显著（P〈0.05）。