人亲环素B基因的克隆表达及重组蛋白的生物活性

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人淋巴细胞中扩增出亲环素Ｂ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＢ，ＣｙＰＢ）基因，克隆入ｐＥＴ－２８ａ载体中表达．表达产物以包涵体形式存在，占细菌可溶性蛋白的１５％．经Ｎｉ－ＮＴＡ树脂金属螯合亲和层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测呈单一条带，毛细管电泳为单一色谱峰，纯度达９５％．经复性处理。

PPIB蛋白对结肠癌成瘤的影响和低氧机制

目的:研究肽酰脯氨基顺反异构酶B(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIB)蛋白对结肠癌细胞成瘤的影响,探讨结肠癌低氧发病的机制。方法:应用RNAi技术,构建下调PPIB蛋白表达的稳转结肠癌细胞株,移植到BALB/c裸鼠皮下,检测PPIB蛋白下调组与对照组的成瘤差异。TUNEL法检测两组移植瘤的细胞凋亡水平。低氧培养结肠癌细胞株,Western印迹法检测PPIB的表达水平与低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的关系。结果:下调PPIB蛋白表达后,在裸鼠皮下成瘤的能力显著减弱。SW480-si PPIB下调组的移植瘤体积显著小于SW480-NC对照组(P<0.01)。TUNEL检测显示下调组的癌细胞凋亡比例显著高于对照组(P<0.001)。在低氧环境下培养后,结肠癌细胞的PPIB蛋白表达水平随着低氧条件下HIF-1α的上调而升高(P<0.05)。结论:PPIB蛋白在结肠癌中因为低氧环境而表达升高,且在升高后通过抑制癌细胞的凋亡而发挥促进结肠癌形成和进展的作用,是一个极具临床应用价值的防治结肠癌的分子靶点。

慢性HBV感染者GPI、MMP-1、MMP-3测定的临床意义

目的:检测葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,GPI)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、MMP-3血清标志物在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(liver cirrhosis,LC)及肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者中的表达水平,探讨其在慢性肝病及肝癌进展过程中的变化及意义。方法:应用酶联免疫吸附试验定量检测受检者血清中GPI、MMP-1、MMP-3的浓度,AU2700全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)及谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST),分析GPI、MMP-1、MMP-3与ALT、AST的相关性。其中CHB 31例,LC 40例、HCC 46例,健康体检者50例。结果:3组肝病患者中血清GPI、MMP-1、MMP-3表达水平均显著高于健康对照组(均P<0.05);在LC患者中,随着AST的增加MMP-3浓度增高,二者呈弱正相关(r=0.18,P<0.05)。AST>40 IU/L LC患者血清MMP-3浓度显著高于AST≤40 IU/L者(P<0.05)。GPI、MMP-1与ALT、AST均无相关性。结论:血清GPI、MMP-1、MMP-3可作为乙型肝炎病毒感染相关肝病肝损伤的诊断指标。

胃癌中FKBP1A高表达的预后价值及其靶向PI3K/AKT对糖代谢的调控作用

背景与目的:胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,FKBP脯氨酸异构酶1A(FKBP prolyl isomerase 1A,FKBP1A)参与多种肿瘤的发生、发展,但在胃癌中的生物学作用及机制尚未明确。本研究旨在探讨FKBP1A在胃癌组织中的表达水平及预后价值,分析其调控胃癌进展的可能途径和机制。方法:免疫组织化学观察FKBP1A在胃癌中的表达情况并结合生物信息学与临床病理学参数分析其与预后不良的相关性;采用Kaplan-Meier生存曲线描述FKBP1A对胃癌患者术后5年生存率的影响,采用COX多因素回归分析探讨影响胃癌患者术后生存率的独立预后因素;通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析FKBP1A表达在胃癌患者中的诊断价值;基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析FKBP1A的生物学功能及可能参与的信号转导通路,体外构建慢病毒转染的MGC803细胞模型,探究FKBP1A对MGC803细胞糖代谢和恶性生物学行为的影响以及可能的分子机制,并构建裸鼠移植瘤模型加以验证。结果:免疫组织化学检测结果显示,FKBP1A在胃癌中呈高表达(P<0.01),生物信息学与临床参数分析结果显示,其与患者预后不良相关;Kaplan-Meier生存分析和COX回归分析显示,FKBP1A表达量与患者5年生存率呈负相关,且其与外周血癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)≥5μg/L、糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)≥37 kU/L、T分期(T3~T4期)和N分期(N2~N3期)是影响胃癌患者术后5年生存率的独立预后因素(P<0.05);ROC曲线分析表明,FKBP1A高表达具有较好的预后诊断价值(P<0.01);GO和KEGG富集分析推测FKBP1A可能参与调节胃癌细胞糖代谢。体外实验显示,过表达FKBP1A促进MGC803细胞糖代谢、增殖、侵袭和迁移,沉默FKBP1A则相反(P<0.05)。在体实验显示,胃癌细胞过表达FKBP1A促进裸鼠移植瘤的生长,而沉默则抑制之(P<0.05)。机制分析表明,过表达FKBP1A上调胃癌细胞中磷酸化的磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和磷酸化的蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的表达,而沉默则下调之(P<0.05)。结论:FKBP1A在胃癌组织中高表达且与患者预后不良相关,可能是通过激活PI3K/AKT促进胃癌细胞的糖代谢和恶性生物学行为。

一种用于proCPB可溶性表达的新型表达系统

目的:构建一种新型可溶性表达系统,实现包括重组猪羧肽酶原B(proCPB)在内的目标蛋白的可溶性表达。方法:通过筛选不同来源的蛋白质二硫键异构酶并与巯基氧化酶进行共表达,并添加N末端标签对这两种蛋白的表达进行优化。结果:在大肠杆菌中,ERV1-TrxsPDI系统与目的蛋白共表达可实现目的蛋白的可溶性表达,且不受到启动子和诱导剂的限制,在重组蛋白生产和新酶工程挖掘等领域具有应用前景。

保加利亚乳杆菌中的亚油酸异构酶的研究

对保加利亚乳杆菌中的亚油酸异构酶的提取和性质进行了研究。利用超声波对乳酸杆菌细胞进行破碎,以提取细胞中的亚油酸异构酶,并就超声波破碎条件对亚油酸异构酶释放的影响进行了研究。通过单因素试验和正交试验得出保加利亚乳杆菌的最佳超声破碎条件为:间歇破碎次数80次(每次破碎3s,中间间隔4s),破碎菌液体积60mL,菌悬液浓度15g/50mL,破碎时的抽提缓冲液最佳pH值4.8,NaCl浓度0.3mol/L。保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶的粗酶液经硫酸铵盐析、超滤、凝胶过滤层析等步骤进行分离纯化后,酶的纯化倍数为23.00。经SDS-PAGE后只显示一条谱带,分子量约为33000D。对保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶的部分酶学性质也进行了研究,结果表明:能专一性地将亚油酸转化为共轭亚油酸,转化产物中活性异构体的比例达到93.626%。

一种新型糖磷酸异构酶在大肠杆菌中的重组表达

核糖-5-磷酸异构酶(RpiB)是新型功能性稀有糖D-阿洛糖生物合成过程中的重要酶。克隆Thermotoga lettingae TMO来源的RpiB基因,以pET-22b(+)为载体,E.coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌。诱导剂IPTG可诱导目的蛋白表达;经金属亲和层析纯化得到电泳纯的重组蛋白,SDS-PAGE显示17ku处出现显著的特征蛋白质条带。活性检测结果表明,该重组RpiB具有较高的产D-阿洛糖生物活性,静息细胞和纯酶反应3h后转化率分别为19%和23%。

miR-4472靶向PIN1调控NF-κB/STAT3信号通路在缺氧缺血性脑病大鼠模型中的作用及机制研究

目的探讨微小RNA(miR)-4472靶向脯氨酸异构酶(PIN1)调控核转录因子(NF)-κB/信号传导子和转录激活子3(STAT3)信号通路在缺氧缺血性脑病大鼠模型(HIE)中的作用及机制。方法究主导单位为嘉兴市第二医院,研究时间为2022年1月至2024年1月。选取Spargue Dawley(SD)大鼠60只,依据随机数字表法将其随机分为六组,各组间体质量差异均无统计学意义(均P>0.05)。分别为正常对照组、HIE模型组、抑制对照组、miR-4472抑制组、抑制miR-4472+干扰对照组、抑制miR-4472+干扰PIN1组,每组10只。采用Rice-Vannucci法建立HIE模型。采用Morris水迷宫实验评价大鼠行为学;采用Longa评分法评价神经功能;采用TUNEL检测凋亡;采用Western blot测定NF-κB和STAT3蛋白表达。结果与HIE模型组比较,miR-4472抑制组和抑制miR-4472+干扰对照组大鼠逃避潜伏期缩短,而抑制miR-4472+干扰PIN1组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.05)。大鼠穿越平台次数比较,抑制miR-4472+干扰PIN1组[(2.13±0.54)次]低于模型组[(3.56±0.71)次]、抑制对照组[(3.61±0.87)次]、miR-4472抑制组[(5.47±1.29)次]和抑制miR-4472+干扰对照组[(5.58±1.32)次](t=5.07、4.57、7.55、7.65,均P<0.05)。大鼠Longa评分比较,抑制miR-4472+干扰PIN1组[(3.03±0.30)分]低于HIE模型组[(2.45±0.54)分]、抑制对照组[(2.38±0.69)分]、miR-4472抑制组[(1.27±0.46)分]和抑制miR-4472+干扰对照组[(1.29±0.51)分](t=2.97、2.73、10.13、9.30,均P<0.05)。大鼠海马神经凋亡率比较,抑制miR-4472+干扰PIN1组[(25.34±6.16)%]低于HIE模型组[(18.42±5.46)%]、抑制对照组[(17.95±4.38)%]、miR-4472抑制组[(8.89±2.10)%]和抑制miR-4472+干扰对照组[(9.13±2.57)%](t=2.97、2.73、10.13、9.30,均P<0.05)。与HIE模型组比较,miR-4472抑制组和抑制miR-4472+干扰对照组大鼠NF-κB和STAT3蛋白灰度值降低,而抑制miR-4472+干扰PIN1组大鼠NF-κB和STAT3蛋白灰度值增加(均P<0.05)。结论miR-4472靶向调控PIN1促进HIE损伤,其机制与激活NF-κB/STAT3信号通路有关。

肽基脯氨酰顺反异构酶B对胰岛细胞中胰岛素表达的影响

目的探讨肽基脯氨酰顺反异构酶B(PPIB)对大鼠胰岛β细胞中胰岛素合成的影响。方法用不同浓度环孢素A 0、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、12.5和15μmol/L处理INS1细胞,采用MTT法检测INS1细胞活力,Western blot法检测INS1细胞中PPIB和胰岛素表达水平。结果环孢素A呈时间和剂量依赖性地抑制INS1细胞活力,降低PPIB和胰岛素含量(P<0.05或P<0.01)。结论环孢素A可能通过下调PPIB表达抑制胰岛细胞中的胰岛素合成。

苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B基因的克隆及表达

[目的]将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi B)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化。[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增Rpi B基因,经酶切连接表达载体p ET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况。通过LC-MS-MS验证重组酶活性。[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 k Da左右。优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多。重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19%。[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的Rpi B酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性。