基于Percoll密度梯度法的轻老龄红细胞膜表面电荷的研究

红细胞衰老过程中膜表面电荷的变化情况与其结构功能密切相关。针对以往研究对轻老龄红细胞膜表面电荷的差异性不确定的问题,本文从不同的细胞分离方法分离轻老龄红细胞的效果不同的角度,通过比较分离出的轻老龄红细胞表面唾液酸的含量和细胞膜的弯曲弹性模量Kc值,提出高速离心法和Percoll密度梯度离心法分离出的轻老龄红细胞间的细胞年龄差距不同,Percoll法分离出的细胞年龄差距更大。利用Percoll密度梯度离心法,进一步分离出四种不同细胞年龄的红细胞,由红细胞表面唾液酸的含量和表面Zeta电位值检验轻老龄红细胞膜表面带电状态的差异性,结果显示,轻老龄红细胞的膜表面电荷存在明显差别,且随着细胞年龄的增长,红细胞的膜表面负电荷逐渐减少。研究结果对红细胞的衰老机制及体内清除老化红细胞的途径等研究具有重要意义。

Percoll密度梯度离心处理对精子功能的影响

Ｐｅｒｃｏｌ密度梯度离心处理对精子功能的影响夏长所高家长张希香朱桂金为了进一步观察经Ｐｅｒｃｏｌ密度梯度离心（ＰｅｒｃｏｌｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎＰ－Ｇ）处理对精子功能的影响，对处理后的精子不同时间的存活率，顶体完整率和体外受精能...

Percoll密度梯度离心法分离中枢神经系统组织中的单个核细胞

目的建立快速分离小鼠中枢神经系统(CNS)组织中单个核细胞的方法。方法以正常C57BL/6小鼠、实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)和阿尔茨海默病(AD)模型小鼠为研究对象,通过70%~30%Percoll密度梯度离心法,获取小鼠脑组织和脊髓中单个核细胞,利用台盼蓝染色检测细胞存活率后,通过流式细胞术进一步分析细胞的表型特点。结果分离得到的单个核细胞存活率在90%以上;流式细胞术分析结果表明,EAE和AD小鼠中浸润到CNS的淋巴细胞群比例明显升高,且介导炎症反应的Th1和Th17细胞亚群比例明显升高,而具有免疫调节作用的Treg细胞亚群比例明显下降。结论采用70%~30%Percoll密度梯度离心法从小鼠CNS中分离的单个核细胞存活率高,细胞活性不受分离过程的影响,可进一步利用流式细胞术分析细胞的表型特征。此方法操作简单快速,适用于对CNS淋巴细胞等单个核细胞的分析。

用percoll密度梯度离心法快速分离提纯大鼠再生肝细胞

报导一种分离和纯化大鼠再生肝细胞的新方法——percoll密度梯度离心法。本方法快速稳定,而且便于提纯和体外培养,细胞成活力高。

Percoll密度梯度离心法在血液组分分离及元素测定中的应用

目的探讨元素在大鼠血液经Percoll密度梯度离心法分离后的不同组分(全血、血浆、红细胞、外周血单个核细胞)中的分布特点。方法将SD大鼠随机分成对照组和不同剂量受试组,共9组。采用4种元素(Hg、I、Mn、Sr)的混合溶液气管滴注染毒,连续染毒10 d后股动脉取血。用Percoll液分离血液,分别收集血浆、红细胞、外周血单个核细胞(PBMC),并用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定全血及上述3种血液成分中4种染毒元素的含量。结果随染毒剂量增加,全血和血浆组分中的元素呈直线回归关系,红细胞与白细胞中部分元素含量与染毒剂量无线性回归关系。结论元素在血液的不同组分中的含量受呼吸道染毒的影响各不相同,利用Percoll密度梯度离心法选取合适的组分可以实现实验目的。

酵母同步细胞的Percoll连续密度梯度改良方法分离及其单细胞拉曼光谱鉴别

利用改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,分离不同酵母菌株稳定期的同步细胞,并在单细胞水平上,应用激光光镊拉曼光谱对分离的同步细胞进行鉴别。采用高速离心机角式转头和2mL聚丙烯离心管,20℃,19 320g离心15min,将大约1.75mL Percoll溶液形成1.00～1.31g·mL^-1连续密度梯度;将样品均匀铺加在离心管连续密度梯度液顶层,20℃,400g离心60min,酵母分成明显的2层细胞带;微分干涉差显微镜（DIC）、相差显微镜以及同步生长曲线分析显示,下层酵母细胞以单个细胞为主,大小均匀、致密,折光性强,生长呈现阶梯式增长,具有同步细胞生长的特性,确定其为同步的G0细胞。利用单细胞光镊拉曼光谱系统对所分离的G0同步细胞与非G0细胞进行分析,结果显示G0同步细胞和非G0细胞的特征峰位置基本一致,但G0细胞对应的蛋白质、糖类、核酸等生物大分子特征峰强度大于非G0细胞,说明G0细胞大分子物质含量要比非G0细胞的高;对G0细胞和非G0细胞进行主成分分析,结果显示,分离的同步化G0细胞之间成分含量差异少,比较均一,而非同步细胞之间内含物质差异大,呈不均一性,说明单细胞光镊拉曼光谱系统可以鉴别同步和非同步细胞。改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,能够分离多数酵母菌株同步化细胞,是一种易操作、成本低、效率高的细胞分离方法。

Percoll密度梯度离心精子优选技术在人类辅助生殖技术中的应用

运用简便而有效的方法对精子进行体外优选,是开展现代辅助生殖技术的基础工作之一。通过优选,去除死亡精子、无活力精子、白细胞及精浆成分,回收高质量的精子。迄今为止,已建立了许多精子优选技术,如精子游动法、玻璃纤维滤过法、血清蛋白滤过法等。而Percoll密度梯度离心法则是以二氧化硅胶体外表裹以聚乙烯吡咯烷酮为介质。

Ficoll和Percoll法分离结直肠癌相关巨噬细胞的比较

目的：比较Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离结直肠癌中的巨噬细胞的效果，并进一步探讨贴壁分离巨噬细胞的最适宜贴壁时间。方法：取结直肠癌患者的肿瘤组织，制成单个细胞的悬液，分别使用100％ Ficoll、35％ Percoll 以及25％与65％双梯度 Percoll 进行巨噬细胞分离，37℃培养2 h后，去除未贴壁的细胞，使用免疫荧光实验来检测巨噬细胞的纯度。之后，将Ficoll分离得到的单个核细胞，分别培养1、2、4和9 h后比较巨噬细胞的纯度。结果：Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离的巨噬细胞的纯度为60．18％，Percoll 非连续密度梯度离心法分离的巨噬细胞的纯度分别为54．33％和10．93％，均低于Ficoll法分离所得到的巨噬细胞的纯度（P ＜0．05）。 Ficoll分离后贴壁1、2、4 h 分离得到的巨噬细胞纯度均达到60％以上，高于贴壁培养9 h得到的巨噬细胞的纯度（34．67％）。结论： Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离巨噬细胞，纯化程度好，是一种简单、高效的巨噬细胞分离方法，适于临床和科研中广泛应用。贴壁培养2～4h是贴壁分离巨噬细胞最适宜的时间。

基于密度梯度法分离纯化的改良培养新生小鼠心肌细胞方法研究

目的基于Percoll不连续密度梯度法分离纯化心肌细胞,建立一个快速稳定提取新生小鼠心肌细胞的原代培养方法。方法在无菌状态下取C57BL/6乳鼠心室,用低浓度Ⅱ型胶原酶消化,通过调整温度、消化方式、离心时间及转速,采用Percoll密度梯度法分离纯化心肌细胞。观察不同时间心肌细胞形态;用0.4%台盼蓝染色检测细胞存活率及细胞数量;采用免疫荧光染色法检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达情况,鉴定心肌细胞及其纯度。结果5次培养结果显示,心肌细胞的平均存活率为(93.12±0.75)%,纯度为(96.36±0.60)%,细胞生长状态良好,可以贴壁自发搏动。结论采用本方法能获得产量、存活率及纯度很高的新生小鼠原代心肌细胞,耗时较短,是一种理想的分离纯化原代心肌细胞的方法,可满足后续各种实验要求。

大鼠骨髓单个核细胞诱导扩增为内皮祖细胞的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件

目的筛选大鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)诱导扩增为内皮祖细胞(BM-EPCs)的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件,构建一个高效、高产量、高纯度的骨髓来源BM-EPCs分离培养诱导扩增方法。方法取2周龄雄性SD大鼠,脱颈处死后分离大鼠双侧胫骨和股骨,收集骨髓细胞悬液。配制30%、50%、60%和70%浓度的Percoll细胞分离液,通过Percoll密度梯度离心法分离出大鼠BMMNCs种子细胞,并计算活细胞比例。将获得的BMMNCs分为1×10^(5)、5×10^(5)、1×10^(6)、2.5×10^(6)、5×10^(6)、1×10^(7)六个组别,分别接种于25 cm^(2)无菌培养瓶中,培养7 d后镜下观察各组细胞集落形成数目,并计算每10^(6)细胞的集落形成数。运用Graphpad prism9.5软件进行Logistic拟合曲线,根据相关系数R^(2)确定相关性,根据其P值将有统计学差异的接种数目纳入范围,随后使用R语言编程定义计算函数,根据已知种子细胞总数及相关性函数限制下,通过迭代寻找最佳的BMMNCs细胞接种数目。分别配制20、50、100 nmol/L浓度的人纤连蛋白(FN)溶液,以不添加FN的空白溶液为对照,分别包被空白培养瓶2、6、12、24 h,将收集的48 h未贴壁BMMNCs接种于FN包被的各培养瓶中,静置培养3 d后计算各组集落形成数目,确定FN包被的最佳浓度与时间。接种48 h未贴壁BMMNCs于25 cm^(2)培养瓶底,使用EGM-2完全培养基定向诱导,于显微镜下观察集落形成及诱导扩增进程。取培养14 d的BM-EPCs,分别采用双阳性染色法和流式细胞术鉴定BM-EPCs的纯度。结果使用Percoll分离法可把BMMNCs细胞清晰的分为5层,其中30%与50%Percoll细胞分离层之间为BMMNCs活细胞比率最高。BMMNCs的最优接种数目为2.5×10^(6)个。以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h皆可有效促进细胞集落形成。细胞接种7 d后获得形态良好的铺路石样细胞并建立生长优势,表明BMMNCs已经诱导成为形态良好的BM-EPCs。Dil-Ac-LDL/FITC-UEA-1双阳性细胞占比为91.89%±5.77%,CD31+KDR阳性率为90.73%±0.61%、CD14阳性率为0.53%±0.17%、CD45阳性率0.77%±0.34%,说明获得的BM-EPCs纯度良好。结论大鼠BMMNCs诱导扩增为BM-EPCs过程中,可使用Percoll密度梯度离心法分离BMMNCs,BMMNCs的最优细胞接种数目为2.5×10^(6)个,细胞培养瓶包被条件为以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h,分离培养诱导获得的BM-EPCs形态和纯度均良好。

大鼠睾丸间质细胞的原代培养、鉴定与功能监测

目的:采用改良方法对大鼠睾丸间质细胞进行分离、纯化和原代培养,以得到更高纯度和稳定的间质细胞原代培养体系。方法:采用酶消化法分离大鼠睾丸间质细胞,再用Percoll连续密度梯度离心除去生精细胞、支持细胞等杂细胞,实现进一步纯化;用3β-HSD特异性染色法鉴定间质细胞,同时采用放射免疫法测定间质细胞睾酮分泌活性。结果:培养的间质细胞纯度达到95%以上,每个睾丸可获取间质细胞约1×106个;通过3β-HSD特异性染色鉴定,该间质细胞胞质呈蓝黑色,而且细胞具有分泌睾酮的活性。结论:酶消化后以Percoll连续密度梯度离心可分离得到高纯度且具有睾酮分泌活性的间质细胞,操作简单易行,实验方法稳定。

柿属植物叶绿体DNA提取方法优化

利用Percoll密度梯度离心法,对4种柿属植物君迁子D.lotus L.、油柿D.oleifera Cheng、浙江柿D.glaucifolia Metc.、金枣柿D.kaki spp.进行叶绿体DNA(cp DNA)提取方法的优化,结果显示优化后的柿属植物cp DNA提取方法具有高效、简便、重复性好、稳定性高的特点;经检验,利用此方法提取的cp DNA质量好,浓度与纯度均较高,能够满足后续叶绿体PCR扩增、基因组测序等分子生物学试验。

改良法分离培养SD新生乳鼠原代心肌细胞

目的:建立一种稳定、快速的SD新生乳鼠原代心肌细胞分离培养改良方法。方法:取SD新生乳鼠心室,0.12%Ⅱ型胶原酶消化,Percoll密度梯度离心结合5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)化学抑制法纯化心肌细胞,体外培养于含5%马血清的改良DMEM/F12中,次日更换为普通含10%胎牛血清的高糖DMEM继续培养,并比较此改良方法与传统差速贴壁法的差异。结果:改良法获得的心肌细胞生长良好,接种24 h后几乎全部贴壁生长,细胞呈三角形、梭形或不规则形,个别细胞出现自主搏动,频率为10~30 beats/min不等。48 h后心肌细胞变长伸出伪足,部分细胞呈现同步搏动,频率接近50~80 beats/min。72 h后心肌细胞成菊花样交织成网,自发搏动趋于同步,频率加快至80~100 beats/min;96 h后细胞聚集成簇,呈岛屿样,同步搏动频率在100~120 beats/min左右,一周内细胞状态良好。改良法纯化原代心肌细胞的得率((1.17±0.15)×10^(6) vs(1.21±0.22)×10^(6),P>0.05)和存活率与传统差速贴壁法相当(93.3%±1.4%vs 92.2%±0.7%,P>0.05),但是改良方法获得的原代心肌细胞纯度更高(94.7%±2.1%vs 89.5%±1.3%,P<0.05),且用时较短((3.1±0.4)h vs(4.3±0.3)h,P<0.01)。结论:改良法获得心肌细胞耗时短、纯度高、结构功能保存完整,且实验重复和稳定性好,是一种理想且简单易行的的原代心肌细胞分离培养方法。

比较两种精子处理技术对体外受精胚胎质量的影响

目的 比较经两种精液处理技术处理的精液对成熟卵的体外受精、卵裂及胚胎质量的影响。方法 将 1999年 12月～ 2 0 0 0年 4月在重庆妇产科医院生殖与遗传中心进行体外受精胚胎移植 (IVF ET)治疗的 6 0例患者以采卵日时间随机分为两组 ,将其精液分别用上游法和两层不连续 percoll密度梯度离心法处理。结果 2 5例上游法组受精率、卵裂率、优质胚胎率分别为94 5 0 %、98 75 %、6 0 34% ;35例两层不连续percoll密度梯度离心技术组受精率、卵裂率、优质胚胎率分别为 94 2 1%、96 91%、6 8 75 %。结论 两种精液处理技术处理的精子在成熟卵的受精率、卵裂率上无差别 ,而两层不连续

麻疯树花粉萌发条件分析及percoll分离体系的建立

为了研究离体条件下,不同培养条件对麻疯树花粉萌发的影响,取盛花期麻疯树花粉,分别在不同琼脂浓度、蔗糖浓度、温度、不同时间段下,检测麻疯树花粉萌发情况.结果表明,麻疯树花粉更易在3%的琼脂浓度、10%的蔗糖浓度、25～30℃的条件下萌发,并以此建立了优良的麻疯树花粉萌发培养基(3%琼脂+10%蔗糖+无机液体培养基).进一步研究显示,一天中的不同时间,麻疯树花粉活力不同,具有两个活力高峰期,分别为上午10～11点和下午16～17点.同时,采用Percoll密度梯度离心法对麻疯树花粉进行分离和筛选,结果表明,该方法可以有效的分离麻疯树花粉,不同层花粉活力不同,其中第六层花粉萌发率可高达90%以上,而前五层花粉萌发率均在30%以下.

从鼠粪中分离纯化微小隐孢子虫卵囊方法的研究

目的探索一种实用、纯度和回收率高且卵囊活力强的分离纯化微小隐孢子虫卵囊的方法。方法分别采用经典的不连续蔗糖密度梯度离心法、改良饱和盐水漂浮法、氯化铯(CsCl)密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法分离纯化C57BL/6小鼠粪中隐孢子虫卵囊。并将4种方法分离纯化获得的卵囊各105体外感染牛输卵管上皮细胞(BFTE),48h和72h后油镜下观察各分离法卵囊的发育情况,以比较卵囊的纯度和活性。结果经典的不连续蔗糖密度梯度离心法分离获得的卵囊数[(2.86±0.08)×107]与改良饱和盐水漂浮法[(2.88±0.15)×107]无明显差异(P>0.05),但高于Percoll密度梯度离心法[(1.52±0.08)×107](P<0.01)和CsCl密度梯度离心法[(2.46±0.13)×107](P<0.05)。4种方法分离纯化的卵囊体外感染BFTE48h和72h后隐孢子虫数无明显差异(P>0.05)。但CsCl密度梯度离心法纯化的隐孢子虫卵囊纯度明显高于不连续蔗糖密度梯度离心法。结论改良饱和盐水漂浮法较经典的不连续蔗糖密度梯度离心法操作简单、快速;CsCl密度梯度离心法分离的隐孢子虫卵囊纯度较高。

人胎儿肝干细胞的分离及鉴定

目的:探索人胎儿肝干细胞的分离及鉴定方法。方法:改进Seglen胶原酶(IV型)原位灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化4～6个月水囊引产男性胎儿的肝干细胞,CO2培养箱培养,光镜、电镜下观察细胞特点,进行肝干细胞细胞标志SABC免疫组化染色。结果:平均细胞产量(2.10±0.50)×107,细胞活性率为(92.30±1.23)%。光镜下呈游离状态、大小不等的单个细胞,约为正常肝细胞1/5～1/3大小;电镜下细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起,卵圆形细胞核,核/浆比例较大等特点;甲胎蛋白、细胞角蛋白8、19及α-1-抗胰蛋白酶免疫组化染色呈阳性,白蛋白及白细胞共同抗原染色呈阴性表现,培养3周可形成克隆样结构。结论:改进的Seglen胶原酶原位灌注结合Percoll密度梯度离心法可成功分离、纯化人胎儿肝干细胞。

不同分离纯化法建立人早孕滋养细胞模型的效果比较

目的对4种建立滋养细胞的方法进行比较,以期寻求一种简便高效的人早孕滋养细胞的体外培养方法,为相关研究提供基础。方法早孕绒毛通过胰酶联合胶原酶消化分离后,分别采用直接接种、差速贴壁联合差速消化法、人外周血淋巴细胞分离液分离纯化法、完整绒毛消化联合简化的percoll密度梯度分离法4种方法纯化培养,倒置显微镜观察细胞形态,应用HE染色、免疫组化和免疫细胞化学法检测细胞纯度。结果直接接种、差速贴壁联合差速消化法、人外周血淋巴细胞分离液分离纯化法得到的细胞细胞角蛋白7(CK-7)表达阳性率不足60%;简化的percoll密度梯度分离法得到的细胞CK-7表达阳性率达90%以上。结论完整绒毛消化联合简化的percoll密度梯度分离纯化可以得到大量较高纯度的滋养细胞以供后期实验。

P物质对哮喘患者嗜酸粒细胞的活化和趋化作用

目的 探讨 P物质 (SP)在嗜酸粒细胞 (Eos)活化中的作用及机制 .方法 以非连续性 Percoll密度梯度分离法分离哮喘患者外周血 Eos,了解 SP对 Eos过氧化物酶 (EPO)活性和脱颗粒的调节作用 ,并以苔盼蓝拒染法评价 SP对 Eos存活时间的影响 .用改良 Boyden法 ,测定 SP对 Eos的趋化活性 ,并观察血小板激活因子 (PAF)对 SP预处理 Eos的趋化作用 .结果 SP能显著增强 EPO活性 ,刺激 Eos脱颗粒 ,且与 PAF有协同性 ,但不能延长 Eos的存活时间 .神经激肽 - 1(NK1)受体拮抗剂 GR712 5 1和磷酯酶 C(PL C)抑制剂新霉素能阻断 SP的上述作用 .SP对 Eos有显著趋化作用 ,其 EC5 0为 1× 10 - 1 4～ 1× 10 - 1 2 m ol· L- 1 ,最大趋化浓度为 1× 10 - 1 0mol· L- 1 ,此后随浓度的增加 ,其趋化作用降低 . PAF对 Eos的趋化作用因 SP预处理 Eos而显著强化 (P<0 .0 1) ,NK1受体拮抗剂 GR712 5 1对 SP的预处理作用有显著的阻断效应 .结论 SP作用于 Eos胞膜上的 NK1受体 ,经百日咳杆菌毒素 (PTX)敏感型 G蛋白 ,活化磷酯酶 C从而激活 Eos.同时SP还是一种 Eos的趋化介质 ,与 PAF有协同作用 。

栽培草莓叶绿体分离与cpDNA的提取方法

以栽培草莓‘红颊’(Fragaria×ananassa Duch.‘Benihoppe’)新鲜幼嫩叶片为材料,利用高盐-低pH的缓冲液结合Percoll密度梯度离心分离纯化叶绿体,再用SDS-蛋白酶K法提取叶绿体DNA(cpDNA)。经荧光显微镜、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测,结果表明:该方法分离的草莓叶绿体完整性高,叶绿体DNA质量好,纯度高,能够满足后续基因组测序等实验的基本要求,为草莓属及其他草本植物cpDNA的提取提供参考。