Percoll梯度离心前后精子功能指标分析

目的 :通过分析Percoll梯度离心法处理前后精子相关功能指标 ,评价该法在精子体外处理中的作用。 方法 :采用多次曝光摄影技术、瑞 姬氏染色法、低渗肿胀实验 ,观察处理前后精子运动速度、顶体完整率和低渗肿胀率的变化。 结果 :2 5例不育病人精液标本经Percoll梯度离心法处理前后 ,精子运动速度 (2 0 .5 6± 8.13μm/s和 2 5 .18± 8.30 μm/s ,P <0 .0 5 )、顶体完整率 (6 1.2 0 %± 2 1.11%和 70 .36 %± 17.70 % ,P <0 .0 1)和低渗肿胀率 (6 8.2 8%±17.33%和 76 .76 %± 17.10 % ,P <0 .0 5 )均有显著差异。 结论 :精液标本经Percoll梯度离心法处理后 ,各项精子功能指标均较处理前有明显改善 ,该法可广泛应用于辅助生殖医学中。

Percoll梯度离心前后精子功能参数的分析

作者通过Percoll梯度离心技术观察处理前后精子相关功能的指标 ,以评价该技术在精子体外处理中的效果 .方法 采用精子前向运动试验 (PMS)、精子尾部低渗肿胀试验 (HOS)和DNA荧光染色有效精子计数试验 (ESC) ,观察精子处理前后PMS ,HOS和ESC的变化 .结果 32例不育病人精液标本经Percoll梯度离心法处理后 ,精子的PMS ,HOS及ESC等指标均明显高于处理前(P <0 .0 1) .该结果表明 ,体外精液标本经Percoll梯度离心法处理后 ,各项精子功能指标均较处理前有明显提高 .

改良Percoll梯度离心法优化精液宫腔内人工授精疗效观察

目的 观察改良Percoll梯度离心法 (简称改良法 )和常规Percoll梯度离心法 (简称常规法 )优化精液行宫腔内人工授精的疗效。方法 选择适应证患者 12 6例 ,共行宫腔内人工授精 2 0 4周期 ,其中 10 6周期应用常规法 ,98周期应用改良法。结果 改良法处理后精子密度、精子活力及周期妊娠率高于常规法 (P <0 .0 5 )。结论 改良法优化精液行宫腔内人工授精具有较高的周期妊娠率 ,疗效较为满意。

Percoll梯度离心结合上游法在人工授精中的应用

精子质量对受孕的影响是不言而喻的。因此，获取质量较好的精子，提高精子运动能力和穿透力，然后进行宫内人工授精，能大大提高受孕机率。但目前所用的精子分离方法，均各自存在一些缺点，如上游法精子必须克服重力向上，对精子活力明显低下的不适用；密度梯度离心技术适...

Percoll梯度离心法分离牛X精子及配种试验

用改良Ｐｅｒｃｏｌｌ梯度柱离心分离牛精子，并将分离后富含Ｘ精子的底层精液进行配种实验。结果发现，底层精子活率正常，含Ｆ小体的Ｙ精子仅１０．２％。将其鲜精直接配种母牛１３头；冻精配种８１头。鲜精组产仔率８４．６％，冻精组为７２．８３％，与对照组比较无差异。母犊出生率，鲜精组为８１．８０％，冻精组为７１．１８％，分别比对照组提高３６．３８％与２５．７８％（Ｐ＜０．０１）。结果表明，此分离方法可提供富含Ｘ精子的精液；应用于人工配种。

酵母同步细胞的Percoll连续密度梯度改良方法分离及其单细胞拉曼光谱鉴别

利用改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,分离不同酵母菌株稳定期的同步细胞,并在单细胞水平上,应用激光光镊拉曼光谱对分离的同步细胞进行鉴别。采用高速离心机角式转头和2mL聚丙烯离心管,20℃,19 320g离心15min,将大约1.75mL Percoll溶液形成1.00～1.31g·mL^-1连续密度梯度;将样品均匀铺加在离心管连续密度梯度液顶层,20℃,400g离心60min,酵母分成明显的2层细胞带;微分干涉差显微镜（DIC）、相差显微镜以及同步生长曲线分析显示,下层酵母细胞以单个细胞为主,大小均匀、致密,折光性强,生长呈现阶梯式增长,具有同步细胞生长的特性,确定其为同步的G0细胞。利用单细胞光镊拉曼光谱系统对所分离的G0同步细胞与非G0细胞进行分析,结果显示G0同步细胞和非G0细胞的特征峰位置基本一致,但G0细胞对应的蛋白质、糖类、核酸等生物大分子特征峰强度大于非G0细胞,说明G0细胞大分子物质含量要比非G0细胞的高;对G0细胞和非G0细胞进行主成分分析,结果显示,分离的同步化G0细胞之间成分含量差异少,比较均一,而非同步细胞之间内含物质差异大,呈不均一性,说明单细胞光镊拉曼光谱系统可以鉴别同步和非同步细胞。改良后的Percoll连续密度梯度分离方法,能够分离多数酵母菌株同步化细胞,是一种易操作、成本低、效率高的细胞分离方法。

基于Percoll密度梯度法的轻老龄红细胞膜表面电荷的研究

红细胞衰老过程中膜表面电荷的变化情况与其结构功能密切相关。针对以往研究对轻老龄红细胞膜表面电荷的差异性不确定的问题,本文从不同的细胞分离方法分离轻老龄红细胞的效果不同的角度,通过比较分离出的轻老龄红细胞表面唾液酸的含量和细胞膜的弯曲弹性模量Kc值,提出高速离心法和Percoll密度梯度离心法分离出的轻老龄红细胞间的细胞年龄差距不同,Percoll法分离出的细胞年龄差距更大。利用Percoll密度梯度离心法,进一步分离出四种不同细胞年龄的红细胞,由红细胞表面唾液酸的含量和表面Zeta电位值检验轻老龄红细胞膜表面带电状态的差异性,结果显示,轻老龄红细胞的膜表面电荷存在明显差别,且随着细胞年龄的增长,红细胞的膜表面负电荷逐渐减少。研究结果对红细胞的衰老机制及体内清除老化红细胞的途径等研究具有重要意义。

Percoll非连续梯度法分离未成年绵羊精原细胞的研究

为探索一种简单可行的分离未成年绵羊精原细胞的方法,采用0.3%的胰蛋白酶消化新鲜采集的4～6月龄未成年绵羊睾丸组织,制备单细胞悬浮液,经Percoll非连续梯度法离心分离,得到自下而上3条清晰的细胞带,用流式细胞仪对各层细胞进行倍性和抗体染色鉴定.结果表明:第一层细胞中的精原细胞含量达到了76.76%,形态良好,活率高于96%.表明试验中所采用的分离方法对未成年绵羊睾丸精原细胞的分离效果较好,所得细胞可用于进一步的研究.

Percoll密度梯度离心法分离中枢神经系统组织中的单个核细胞

目的建立快速分离小鼠中枢神经系统(CNS)组织中单个核细胞的方法。方法以正常C57BL/6小鼠、实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)和阿尔茨海默病(AD)模型小鼠为研究对象,通过70%~30%Percoll密度梯度离心法,获取小鼠脑组织和脊髓中单个核细胞,利用台盼蓝染色检测细胞存活率后,通过流式细胞术进一步分析细胞的表型特点。结果分离得到的单个核细胞存活率在90%以上;流式细胞术分析结果表明,EAE和AD小鼠中浸润到CNS的淋巴细胞群比例明显升高,且介导炎症反应的Th1和Th17细胞亚群比例明显升高,而具有免疫调节作用的Treg细胞亚群比例明显下降。结论采用70%~30%Percoll密度梯度离心法从小鼠CNS中分离的单个核细胞存活率高,细胞活性不受分离过程的影响,可进一步利用流式细胞术分析细胞的表型特征。此方法操作简单快速,适用于对CNS淋巴细胞等单个核细胞的分析。

用percoll密度梯度离心法快速分离提纯大鼠再生肝细胞

报导一种分离和纯化大鼠再生肝细胞的新方法——percoll密度梯度离心法。本方法快速稳定,而且便于提纯和体外培养,细胞成活力高。

Ficoll和Percoll法分离结直肠癌相关巨噬细胞的比较

目的：比较Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离结直肠癌中的巨噬细胞的效果，并进一步探讨贴壁分离巨噬细胞的最适宜贴壁时间。方法：取结直肠癌患者的肿瘤组织，制成单个细胞的悬液，分别使用100％ Ficoll、35％ Percoll 以及25％与65％双梯度 Percoll 进行巨噬细胞分离，37℃培养2 h后，去除未贴壁的细胞，使用免疫荧光实验来检测巨噬细胞的纯度。之后，将Ficoll分离得到的单个核细胞，分别培养1、2、4和9 h后比较巨噬细胞的纯度。结果：Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离的巨噬细胞的纯度为60．18％，Percoll 非连续密度梯度离心法分离的巨噬细胞的纯度分别为54．33％和10．93％，均低于Ficoll法分离所得到的巨噬细胞的纯度（P ＜0．05）。 Ficoll分离后贴壁1、2、4 h 分离得到的巨噬细胞纯度均达到60％以上，高于贴壁培养9 h得到的巨噬细胞的纯度（34．67％）。结论： Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离巨噬细胞，纯化程度好，是一种简单、高效的巨噬细胞分离方法，适于临床和科研中广泛应用。贴壁培养2～4h是贴壁分离巨噬细胞最适宜的时间。

Percoll、白蛋白处理前后精子低渗肿胀百分率的比较

本文报告了用低渗肿胀试验观察经Percoll梯度离心和白蛋白柱处理前后的精子低渗肿胀率，结果显示：Percoll、白蛋白柱处理前精子低渗肿胀率为73．8±8．0％。处理后的精子低渗肿胀率分别为84.6±72％、87．7±8.1％．与处理前比较差异均非常显著。提示精液经体外处理后再行人工授精是治疗不育症的一种手段。

大鼠骨髓单个核细胞诱导扩增为内皮祖细胞的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件

目的筛选大鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)诱导扩增为内皮祖细胞(BM-EPCs)的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件,构建一个高效、高产量、高纯度的骨髓来源BM-EPCs分离培养诱导扩增方法。方法取2周龄雄性SD大鼠,脱颈处死后分离大鼠双侧胫骨和股骨,收集骨髓细胞悬液。配制30%、50%、60%和70%浓度的Percoll细胞分离液,通过Percoll密度梯度离心法分离出大鼠BMMNCs种子细胞,并计算活细胞比例。将获得的BMMNCs分为1×10^(5)、5×10^(5)、1×10^(6)、2.5×10^(6)、5×10^(6)、1×10^(7)六个组别,分别接种于25 cm^(2)无菌培养瓶中,培养7 d后镜下观察各组细胞集落形成数目,并计算每10^(6)细胞的集落形成数。运用Graphpad prism9.5软件进行Logistic拟合曲线,根据相关系数R^(2)确定相关性,根据其P值将有统计学差异的接种数目纳入范围,随后使用R语言编程定义计算函数,根据已知种子细胞总数及相关性函数限制下,通过迭代寻找最佳的BMMNCs细胞接种数目。分别配制20、50、100 nmol/L浓度的人纤连蛋白(FN)溶液,以不添加FN的空白溶液为对照,分别包被空白培养瓶2、6、12、24 h,将收集的48 h未贴壁BMMNCs接种于FN包被的各培养瓶中,静置培养3 d后计算各组集落形成数目,确定FN包被的最佳浓度与时间。接种48 h未贴壁BMMNCs于25 cm^(2)培养瓶底,使用EGM-2完全培养基定向诱导,于显微镜下观察集落形成及诱导扩增进程。取培养14 d的BM-EPCs,分别采用双阳性染色法和流式细胞术鉴定BM-EPCs的纯度。结果使用Percoll分离法可把BMMNCs细胞清晰的分为5层,其中30%与50%Percoll细胞分离层之间为BMMNCs活细胞比率最高。BMMNCs的最优接种数目为2.5×10^(6)个。以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h皆可有效促进细胞集落形成。细胞接种7 d后获得形态良好的铺路石样细胞并建立生长优势,表明BMMNCs已经诱导成为形态良好的BM-EPCs。Dil-Ac-LDL/FITC-UEA-1双阳性细胞占比为91.89%±5.77%,CD31+KDR阳性率为90.73%±0.61%、CD14阳性率为0.53%±0.17%、CD45阳性率0.77%±0.34%,说明获得的BM-EPCs纯度良好。结论大鼠BMMNCs诱导扩增为BM-EPCs过程中,可使用Percoll密度梯度离心法分离BMMNCs,BMMNCs的最优细胞接种数目为2.5×10^(6)个,细胞培养瓶包被条件为以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h,分离培养诱导获得的BM-EPCs形态和纯度均良好。

基于密度梯度法分离纯化的改良培养新生小鼠心肌细胞方法研究

目的基于Percoll不连续密度梯度法分离纯化心肌细胞,建立一个快速稳定提取新生小鼠心肌细胞的原代培养方法。方法在无菌状态下取C57BL/6乳鼠心室,用低浓度Ⅱ型胶原酶消化,通过调整温度、消化方式、离心时间及转速,采用Percoll密度梯度法分离纯化心肌细胞。观察不同时间心肌细胞形态;用0.4%台盼蓝染色检测细胞存活率及细胞数量;采用免疫荧光染色法检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达情况,鉴定心肌细胞及其纯度。结果5次培养结果显示,心肌细胞的平均存活率为(93.12±0.75)%,纯度为(96.36±0.60)%,细胞生长状态良好,可以贴壁自发搏动。结论采用本方法能获得产量、存活率及纯度很高的新生小鼠原代心肌细胞,耗时较短,是一种理想的分离纯化原代心肌细胞的方法,可满足后续各种实验要求。

Percoll密度梯度离心法在血液组分分离及元素测定中的应用

目的探讨元素在大鼠血液经Percoll密度梯度离心法分离后的不同组分(全血、血浆、红细胞、外周血单个核细胞)中的分布特点。方法将SD大鼠随机分成对照组和不同剂量受试组,共9组。采用4种元素(Hg、I、Mn、Sr)的混合溶液气管滴注染毒,连续染毒10 d后股动脉取血。用Percoll液分离血液,分别收集血浆、红细胞、外周血单个核细胞(PBMC),并用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定全血及上述3种血液成分中4种染毒元素的含量。结果随染毒剂量增加,全血和血浆组分中的元素呈直线回归关系,红细胞与白细胞中部分元素含量与染毒剂量无线性回归关系。结论元素在血液的不同组分中的含量受呼吸道染毒的影响各不相同,利用Percoll密度梯度离心法选取合适的组分可以实现实验目的。

人睾丸组织中成熟精子的分离方法初探

探索简单、适用的体外分离睾丸组织中成熟精子的方法,以用于男性无精子症病人行卵母细胞内单精子注射受精-胚胎移植为目的。用含不同浓度透明质酸酶的10 %人血白蛋白人类输卵管液培养人睾丸曲细精管组织匀浆2 4 h,再用Percoll梯度离心法洗涤后计算所获各级精子的总数,并设置前后对照和空白对照进行比较。用不同浓度透明质酸酶处理后的4个实验组分别与2个对照组比较,实验组所获得的各级精子的总数高于对照组,有显著差异(P<0 .0 1)。实验组中透明质酸酶浓度分别为5 0、10 0、15 0 u/ ml的10 %人血白蛋白人类输卵管液处理组获得的各级精子总数组间比较,处理前对照和处理后空白对照之间比较,无显著差异(P>0 .0 5 )。而用浓度为2 0 0 u/ ml的10 %人血白蛋白人类输卵管液处理组获得的各级精子的总数与其它浓度处理组之间比较存在统计学差异(P<0 .0 1) ,其所获得的各级精子总数相似,但活动能力较其它浓度处理组低。透明质酸酶结合Percoll梯度离心可从人睾丸曲细精管组织匀浆中分离出较多更纯的成熟精子,但过高浓度的透明质酸酶可能会影响分离出的精子的活动能力。

PureSperm离心法在宫腔内人工授精周期中优选精子的应用

目的 :探讨PureSperm离心法在宫腔内人工授精 (IUI)周期中优选精子的效果。 方法 :采用PureSperm单、双梯度离心法及Percoll双梯度离心法分别处理精液 ,比较 3种方法的处理效果 ,并将处理后的精子悬液施行夫精IUI。 结果 :单梯度PureSperm较双梯度的PureSperm及Percoll洗涤后精子密度显著增加 (P <0 .0 1) ,双梯度PureS perm及Percoll离心法两者差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,3种方法在洗涤后精子活率、畸形率及妊娠率比较差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。洗涤后正常形态的精子数量明显增加 ,白细胞、上皮细胞及细胞碎片等非精子成分明显减少。 结论 :PureSperm离心法是一种高效、简便、安全的IUI精液处理方法。

小鼠睾丸精子细胞的分离与鉴定

目的 :建立一种简单、可有效分离小鼠睾丸精子细胞的方法。 方法 :用组合酶消化成年小鼠睾丸制备睾丸细胞悬液 ,然后经 6层非连续Percoll梯度 (15 %、2 2 %、30 %、4 0 %、5 0 %和 6 0 % )离心法分离 ,通过形态学和流式细胞术鉴定各个Percoll梯度中精子细胞的含量 ,并以伊红Y排斥试验测定细胞的存活率。 结果 :组合酶消化后获得的睾丸细胞悬液中 ,97%以上细胞仍然存活。经Percoll梯度离心 ,共形成 6条细胞带 ,其中 2 2 %梯度中主要为精子细胞 (平均 86 .7% ,P <0 .0 5 ) ,85 .5 %以上细胞存活 ;而 30 %梯度中细胞密度最高 (P <0 .0 5 ) ,含有各级未成熟生精细胞 ,存活细胞超过 92 %。 结论 :采用组合酶消化结合非连续Percoll梯度离心法 。

不育病人精液中精子细胞的分离与鉴定

目的 :建立一种可从不育病人精液中分离出较多、较纯精子细胞的新方法。 方法 :收集 15例含细胞成分的不育病人精液 ,利用一种改良的非连续Percoll梯度 (15 %、2 2 %、30 %、4 0 %、5 0 %和 6 0 % )离心法分离精子细胞。于 18℃ 2 0 0 0r/min离心 30min后 ,精液细胞被分成单个的细胞组分 ;然后通过细胞计数、形态学、流式细胞术 (FCM )和免疫细胞化学等方法进行分析 ,选择含精子细胞纯度最高的组分。 结果 :经Percoll梯度离心后获得6个细胞组分 ,形态学和FCM分析表明 ,2 2 %组分中主要为精子细胞 [(91.85± 5 .18) % ,P <0 .0 0 5 ],平均密度为(1.0 10± 0 .786 )× 10 5/ml;30 %组分中含包括精子细胞在内的各种未成熟生精细胞 ;而白细胞主要位于 6 0 %组分中。 结论 :利用这种改良的非连续Percoll梯度离心法 ,可从不育病人的精液中分离到较多。