美洲大蠊提取物CⅡ-3调控p16^(INK4a)诱导SKOV3细胞衰老

目的探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3调控p16^(INK4a)蛋白诱导卵巢癌细胞SKOV3衰老的作用。方法通过CCK-8法测定不同浓度和时间美洲大蠊提取物CⅡ-3对SKOV3细胞增殖的作用;运用细胞集落形成实验测定美洲大蠊提取物CⅡ-3对SKOV3细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测CⅡ-3作用后SKOV3细胞周期的变化;衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测CⅡ-3作用后SKOV3细胞衰老变化;Western Blotting检测CⅡ-3作用后SKOV3细胞衰老调控分子p16^(INK4a)蛋白表达的变化。结果美洲大蠊提取物CⅡ-3可有效抑制SKOV3细胞增殖,最佳作用浓度为80μg/mL,作用时间为48 h;CⅡ-3作用后,SKOV3细胞集落形成能力下降;阻滞于G_(0)/G_(1)期细胞比例增高,S期细胞比例减少;SA-β-Gal阳性细胞百分比增加;衰老调控分子p16^(INK4a)蛋白表达上调。结论美洲大蠊提取物CⅡ-3通过调控衰老调控分子p16^(INK4a)蛋白表达诱导SKOV3细胞衰老。

美洲大蠊提取物CⅡ-3对肝癌TAE术后细胞黏附分子水平的影响及其对肝脏的保护作用

目的 探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3对肝癌经导管动脉栓塞(transcatheter arterial embolization, TAE)术后癌旁肝组织细胞黏附分子水平的影响及其对肝脏的保护作用。方法 东南大学荷瘤兔2只,新西兰大白兔50只。开腹瘤粒注射法建立兔VX2肝癌模型,影像学确认是否造模成功并评估肿瘤种植情况。将成功建模的45只实验兔随机分为3组,每组15只。对照组不做处理,TAE组用碘化油栓塞肿瘤供血动脉,CⅡ-3组于TAE术前连续3 d耳缘静脉注射CⅡ-3(16 mg/kg)。化学比色法检测各组实验兔术前及术后血清ALT及AST。免疫组化法检测各组癌旁肝组织PPAR-α、NF-κB表达水平。ELISA法检测各组癌旁肝组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)水平。RTPCR检测各组癌旁肝组织PPAR-α、NF-κB、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平。结果术前对照组、TAE组、CⅡ-3组ALT水平分别为(34.49±1.33)、(34.01±1.21)、(34.06±1.23) U/L,AST水平分别为(38.44±1.41)、(38.45±1.47)、(38.42±1.38) U/L,差异无统计学意义(P>0.05);术后对照组、TAE组、CⅡ-3组ALT水平分别为(35.61±1.56)、(118.67±3.39)、(87.24±3.67) U/L,AST水平分别为(41.03±1.83)、(220.60±3.00)、(104.46±2.66) U/L;与对照组比较,TAE组、CⅡ-3组ALT及AST水平明显上升,但CⅡ-3组ALT及AST水平低于TAE组,差异均有统计学意义(P<0.01)。对照组、TAE组、CⅡ-3组ICAM-1水平分别为(1.74±0.13)、(3.43±0.19)、(1.81±0.13) ng/L;VCAM-1水平分别为(1.66±0.05)、(2.18±0.06)、(1.67±0.06) ng/L。对照组、TAE组、CⅡ-3组PPAR-α阳性分别为4、3、10只,NF-κB阳性分别为2、11、3只,与对照组、CⅡ-3组比较,TAE组NF-κB阳性率、NF-κB mRNA水平和ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA水平明显升高;与对照组、TAE组比较,CⅡ-3组PPAR-α蛋白及mRNA水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 CⅡ-3可通过拮抗NF-kB的表达,降低ICAM-1、VCAM-1水平,达到减轻炎症反应,降低TAE术后肝损伤的作用。

美洲大蠊提取物CⅡ-3调控p53蛋白抑制K562细胞增殖

目的:探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3对人白血病细胞K562增殖的影响。方法:以不同浓度的美洲大蠊提取物CⅡ-3作用于K562细胞,CCK-8法检测其对细胞增殖的影响,集落形成实验检测其对细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测K562细胞的细胞周期,蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化p53蛋白的表达。结果:美洲大蠊提取物CⅡ-3可抑制K562细胞增殖,其最佳作用浓度为80μg/mL,作用时间72 h;CⅡ-3能降低K562细胞集落形成率;使阻滞在G0/G1期的K562细胞比例增高,S期的细胞比例减少;促进磷酸化p53蛋白表达上调。结论:CⅡ-3通过调控p53蛋白抑制K562细胞增殖。

美洲大蠊提取物CⅡ-3对荷S180肉瘤小鼠抑瘤作用及机制初探

目的:探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3对荷S180肉瘤小鼠抑瘤作用及机制。方法:将荷S180肉瘤小鼠随机分为模型组、阳性对照(CTX)组、CⅡ-3高、中、低剂量组,另设正常对照组,每组10只小鼠,观察给药后各组小鼠肿瘤组织的病理改变,计算抑瘤率;ELISA试剂盒检测血清中血管内皮生长因子(VEGF)和端粒酶(TE)水平;免疫组织化学法检测肿瘤组织中p53、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、微血管密度(MVD)和环氧合酶-2(COX-2)蛋白的表达。结果:CTX组、CⅡ-3高、中、低剂量组小鼠抑瘤率分别为85.71%、55.71%、44.28%、34.28%。CⅡ-3高、中剂量组小鼠肿瘤组织坏死区域明显。与模型组相比,CⅡ-3高剂量组小鼠血清中TE活力降低(P<0.05),CⅡ-3高、中剂量组小鼠肿瘤组织中p53、Bcl-2、MVD、COX-2表达显著降低(P<0.01),Caspase-3表达显著增加(P<0.01)。结论:CⅡ-3能显著抑制S180肉瘤的生长,其机制可能与降低TE活力,减少肿瘤组织中p53、Bcl-2、MVD、COX-2表达,增加Caspase-3表达等途径相关。

美洲大蠊提取物CⅡ-3对白假丝酵母菌生物膜形成的作用

目的:探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3(以下简称“CⅡ-3”)对白假丝酵母菌生物膜形成的影响,为研发抗真菌生物膜药物奠定基础。方法:将CⅡ-3加入白假丝酵母菌液与生物膜共孵育,分别设CⅡ-3高剂量组、CⅡ-3低剂量组、阳性对照组和阴性对照组,采用形态观察法及MTT法检测CⅡ-3对白假丝酵母菌生物膜形成的作用,计算生物膜抑制率评估不同浓度CⅡ-3对不同生长阶段白假丝酵母菌生物膜的作用效果。结果:CⅡ-3作用下白假丝酵母菌仍能形成生物膜样结构,高剂量组生物膜抑制率分别为25.1%和13.9%,均低于氟康唑生物膜抑制率(79.3%);与不同生长阶段白假丝酵母菌生物膜孵育时,CⅡ-3对生长8 h生物膜抑制率最高(61.7%),其次是生长16 h和24 h生物膜的抑制率(35.4%和21.9%),氟康唑仅对生长4 h白假丝酵母菌生物膜有明显抑制作用(抑制率75.5%),对其他生长阶段白假丝酵母菌生物膜抑制作用不显著,CⅡ-3对白假丝酵母菌聚集和成熟期生物膜的抑制作用是氟康唑的2~9倍。结论:CⅡ-3主要在聚集和成熟阶段抑制白假丝酵母菌生物膜形成,抑制作用未见明显量效关系。

美洲大蠊提取物CⅡ-3对MFC荷瘤小鼠抑瘤机制的~1H-NMR代谢组学研究

目的:初步研究美洲大蠊提取物CⅡ-3对上皮肿瘤细胞MFC荷瘤小鼠的抑瘤机制。方法:将Balb/c小鼠随机分为模型组(生理盐水20 mL/kg)和CⅡ-3组(200 mg/kg),每组6只。在小鼠右侧腋下注射MFC细胞悬液0.2 mL后,于次日灌胃相应药物,每日1次,连续10 d。末次给药24 h后,在测量瘤体大小的基础上,采用氢-1核磁共振技术(~1H-NMR)并结合非监督型主成分分析(PCA)、监督型偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),比较两组荷瘤小鼠肝组织的代谢谱并分析差异性代谢物,探索CⅡ-3抑瘤作用的潜在机制。结果:与模型组比较,CⅡ-3组荷瘤小鼠的瘤体明显减小;两组小鼠的~1H-NMR图谱存有差异;结合非监督型PCA、监督型PLS-DA、OPLS-DA结果,共确定了肝组织潜在差异性代谢物6个,分别为糖原(升高)、丙酮酸(降低)、精氨酸(降低)、羟脯氨酸(升高)、肌苷(升高)、烟酰胺(升高),主要归属于精氨酸代谢、能量代谢和核酸代谢。结论:CⅡ-3对MFC荷瘤小鼠的抑瘤作用可能与调节精氨酸代谢、能量代谢和核酸代谢有关。

美洲大蠊提取物CⅡ-3调控SIRT1/mTOR信号通路诱导白血病K562细胞衰老

该研究旨在探讨沉默信息调节因子2相关酶1(slient mating-type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)/结节性硬化症复合物Ⅱ(tuberous sclerosis complex 2,TSC2)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在美洲大蠊提取物CⅡ-3诱导人白血病细胞K562细胞衰老中的作用。体外培养K562细胞,设对照组(0μg·mL^(-1))及美洲大蠊提取物CⅡ-3不同剂量组(5、10、20、40、80、160μg·mL^(-1)),细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测CⅡ-3对K562细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测CⅡ-3对K562细胞周期分布的影响;β-半乳糖苷酶染色试剂盒(senescence-associatedβ-galactosidase stain kit,SA-β-gal)检测衰老细胞染色阳性百分率;流式细胞术检测线粒体膜电位的改变;荧光定量PCR检测端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)的表达;荧光定量PCR和免疫印迹法(Western blot)检测SIRT1、TSC2和mTOR mRNA及蛋白的表达。结果显示,经美洲大蠊提取物CⅡ-3诱导作用后,CⅡ-3组细胞增殖抑制率高于对照组,当CⅡ-3质量浓度为80μg·mL^(-1),作用时间为72 h时,CⅡ-3对K562细胞的增殖抑制率最高,故选为实验标准进行后续研究。与对照组相比,CⅡ-3组阻滞在G0/G1的细胞比例升高,S期细胞比例降低;细胞SA-β-Gal衰老染色阳性率升高;线粒体膜电位降低;端粒酶TERT mRNA表达下调;SIRT1和TSC2 mRNA的表达下调,mTOR mRNA的表达上调;SIRT1和p-TSC2蛋白的表达下调,p-mTOR蛋白的表达上调。以上研究结果表明,美洲大蠊提取物CⅡ-3可通过SIRT1/mTOR信号通路诱导K562细胞衰老。

美洲大蠊提取物CⅡ-3对肝癌H22荷瘤小鼠作用研究

目的美洲大蠊提取物CⅡ-3在体内外有抑制肿瘤生长和改善免疫功能的作用。本研究在前期研究的基础上观察CⅡ-3单药对比联合环磷酰胺(cycolophosphamide,CTX)对小鼠肝癌H22移植性实体瘤的治疗效果,探讨CⅡ-3在肿瘤治疗中的作用。方法建立Balb/c小鼠H22腋下实体瘤模型,并将80只小鼠随机分为对照组、CTX组(20mg/kg)、CTX+CⅡ-3联合给药组(CTX 20mg/kg,CⅡ-3 50、100和200mg/kg)、CⅡ-3给药组(50、100和200 mg/kg)。连续给药12d后,测定其抑瘤率脏器指数,外周血细胞数量,T、B淋巴细胞转化功能及NK细胞杀伤活性。结果对照组的瘤块质量为(1.21±0.28)g,CTX组为(0.73±0.27)g,CTX联合CⅡ-3低、中、高剂量给药后的瘤块质量为(0.40±0.21)、(0.43±0.11)和(0.41±0.19)g,CⅡ-3低、中、高剂量组的瘤块质量分别为(0.93±0.39)、(0.94±0.31)和(0.96±0.16)g,与对照组和CTX组相比,联合给药组肿瘤生长速度明显减慢,差异有统计学意义,F=8.916,P<0.05。CTX组白细胞的数量为(1.56±0.64)×109 L-1,CTX联合CⅡ-3低剂量组为(4.47±0.91)×109 L-1,显著改善外周血象,F=2.476,P<0.05。对照组小鼠肝脏指数为(6.101±0.412)mg/10g,CTX组为(5.112±0.463)mg/10g,中剂量CⅡ-3联合CTX给药后肝脏指数可高达(5.882±0.548)mg/10g,减轻了CTX对肝脏的损伤,F=4.225,P<0.01。对照组小鼠脾脏指数为(0.659±0.148)mg/10g,CTX组的脾脏受到严重损伤,其指数为(0.314±0.092)mg/10g,联合给药后可以显著地减轻CTX对脾脏的损伤,其指数为(0.569±0.033)mg/10g,F=5.667,P<0.05;对照组小鼠的胸腺指数为(0.060±0.018)mg/10g,给予CTX后小鼠的脏器受到严重的损伤,胸腺指数为(0.024±0.004)mg/10g,CⅡ-3联合CTX给药后胸腺指数为(0.056±0.014)mg/10g,减轻了CTX对胸腺的损伤,对胸腺有一定的保护作用,F=4.729,P<0.05。荷瘤小鼠在给予CTX治疗后,T、B淋巴细胞的转化功能及NK细胞杀伤力显著地降低(P<0.05,P<0.01),CⅡ-3联合CTX可提高T、B淋巴细胞的转化功能及NK细胞杀伤力(P<0.05,P<0.01),从而增强机体的免疫功能。结论 CⅡ-3联合CTX治疗H22荷瘤小鼠可提高抑瘤率,具有提高CTX治疗效果的作用,其增效作用是通过提高T、B淋巴细胞的转化功能及NK细胞杀伤力实现的。除此之外CⅡ-3还具有减毒作用,其减毒作用是通过改善白细胞、红细胞和血小板的数量,提高脏器指数实现的。

苦参总碱和美洲大蠊提取物对孕激素受体阴性的子宫内膜癌细胞株JEC的作用研究

为了探讨苦参总碱、美洲大蠊提取物及两者联合用药对孕激素受体(PR)阴性的子宫内膜癌细胞株JEC的作用。笔者通过MTT法、流式细胞仪、Western blot检测苦参总碱、美洲大蠊提取物和两者联合用药后对JEC细胞的生长抑制、细胞周期及P53和c-erb B-2基因蛋白的表达影响。结果发现,1MTT法:苦参总碱和美洲大蠊提取物对JEC的生长均有抑制作用,且联合给药后抑制作用显著提高。2流式细胞仪分析:苦参总碱组细胞在G0/G1期的比例上升,美洲大蠊提取物组细胞在G2/M期比例上升,联合给药组的G0/G1期比例较其他2组显著上升,细胞生长受到抑制(P<0.05)。3Western blot法:苦参总碱组、美洲大蠊提取物组和联合给药组作用JEC细胞后,P53蛋白的表达水平上调,c-erb B-2蛋白表达水平下降(P<0.05)。以上结果说明苦参总碱、美洲大蠊提取物及联合给药对JEC细胞的生长均有抑制作用,且能通过上调P53和下调c-erb B-2蛋白的表达诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖。

美洲大蠊多肽对L1210荷瘤小鼠抗肿瘤免疫的初步研究

目的探索美洲大蠊精制物CⅡ3及相关合成短肽HFDT1在小鼠体内的抗肿瘤作用及其对免疫功能的影响。方法取BALB/c小鼠60只,建立小鼠白血病细胞L1210荷瘤模型,随机分为5组,用美洲大蠊精制物CⅡ3高、低剂量及相关人工合成短肽HFDT1连续给药10 d,设环磷酰胺(CTX)为阳性对照,模型组给予生理盐水,另取BALB/c小鼠12只作为正常对照,评估受试药的肿瘤抑制作用及对小鼠体重的影响;然后取小鼠胸腺、脾脏、外周血,通过称重、血细胞自动分析、流式细胞术、双抗体夹心ELISA等方法分析胸腺及脾脏指数、外周血免疫细胞数量的变化、脾脏淋巴细胞及B细胞(CD45R~^+细胞)与T细胞(CD3^+细胞)比例变化、T细胞亚群(CD3^+ CD4^+细胞与CD3^+ CD8^+细胞)的变化、小鼠血清免疫球蛋白含量的变化。结果 CⅡ3及HFDT1能抑制小鼠L1210瘤的生长且不降低荷瘤小鼠的体重;CⅡ3及HFDT1能有效的上调荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数,能显著提高荷瘤小鼠外周血免疫细胞的数量;能维持脾脏淋巴细胞含量,调节T、B淋巴细胞和CD3^+ CD4^+细胞与CD3^+ CD8^+T的比例;能够提高血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的水平。结论美洲大蠊精制物CⅡ3及相关合成短肽HFDT1可通过增强荷瘤小鼠抗肿瘤免疫功能,发挥抗肿瘤活性,有望成为低毒有效的抗肿瘤候选药,特别是HFDT1,因能够通过人工方法大量合成,具有很大的应用前景。