Development of a Duplex Real-time PCR assay for Detection of Perkinsus and Marteilia refringens in Shellfish

[ Objective] To improve the accuracy and efficiency of the detection which used in Perkinsus sp and Marteilia refringens, and then short- en the detective cycle. [ Method] According to the gene sequence of Perkinsus sp and Marteilia refringens from gene bank, design two pairs of spe- cific primers and two TaqMan probes with different fluorophores labeled. Optimizing the reactive conditions and reagent concentration in order that establishing the duplex real-time PCR method for detecting Perkinsus sp and Marteilia refringens simultaneously. [ Result ] The sensitivity of the du- plex real-time PCR method which about Pertdnsus sp and Marteilia refringens is 40 template copies. After combine the templates of Perkinsus sp and Marteilia refringens with different concentrations, this method still could be detect this two protozoan efficiently and synchronously. [ Condudon] The es- tablished duplex real-time PCR method for detecting Perkinsus sp. and Marteilia refringens possesses lots of advantages, such as specific, sensitive, rapid, quantitative and reproducible, can be used for clinical detection of infection which was caused by Perkinsus sp. and Marteilia refringens.

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这2种原虫的二重PCR。对同一样品中的单孢子虫和折光马尔太虫模板DNA进行扩增,得到2条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)和478 bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对派琴虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果均为阴性。敏感性试验表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫和折光马尔太虫DNA。

贝类派琴虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫基因序列,设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测派琴虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;对派琴虫和折光马尔太虫不同浓度模板进行组合,该方法仍可有效地同时检测出这二种原虫。研究建立的派琴虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。

同时检测海洋贝类包纳米虫和派琴虫的双重TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法

根据包纳米虫(Bonamia sp.)SSU rDNA和派琴虫(Perkinsus sp.)ITS rDNA的保守区序列,设计特异性引物和Taqman MGB探针,建立了同时检测上述两种贝类原虫的双重实时荧光PCR方法.该方法可检测到包纳米虫基因的446拷贝质粒,以及派琴虫基因的171拷贝质粒,具有较高的灵敏度.以10倍系列稀释的包纳米虫阳性标准品质粒和派琴虫阳性标准品质粒为模板,测得该方法的定量标准曲线相关系数分别为0.999和1.000,显示出很好的扩增效率.同时该方法与尼氏单孢子虫(Haplosporidium nelsoni)、沿岸单孢子虫(H.costale)等其他贝类原虫,以及副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和鮰爱德华氏菌(E.ictaluri)等海水养殖常见致病菌之间无交叉反应,表现出较高的特异性.福建莆田的湄州湾、平海湾、兴化湾等地采集的296份贝类临床样本的检测证明,该方法是一种有效的快速检测鉴定上述2种贝类原虫的方法,具有良好的灵敏度和特异性,可广泛应用于海洋贝类原虫感染情况调查,以及贝类疫病检疫监控等领域.

贝类派琴虫和折光马尔太虫二重PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了二对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这二种原虫的多重PCR。该技术对同一样品中的派琴虫和折光马尔太虫模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与实验设计相符的596bp(派琴虫)和478bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pg的派琴虫和折光马尔太虫DNA。用该二重PCR对广西沿海的119份牡蛎样品进行检测,结果派琴虫和折光马尔太虫的阳性率分别为9.24%和1.68%,提示了中国南方沿海的养殖贝类中存在派琴虫和折光马尔太虫的感染。

3种贝类原虫多重荧光定量PCR方法的建立

目的:建立能够同时检测单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量PCR方法。方法:根据基因库中单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的基因序列,设计3对特异性引物和3条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量PCR方法。结果:该方法对单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性分别达到40、400和40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这3种原虫,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果均为阴性。结论:建立的单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫多重荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。

贝类包拉米虫和派琴虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中包拉米虫和派琴虫保守基因序列,用Primer Express3.0软件设计合成了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对包拉米虫和派琴虫的检测敏感性达到200个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对包拉米虫和派琴虫不同模板浓度进行组合,仍可有效同时检测到这两个原虫。该方法对单孢子虫、马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的包拉米虫和派琴虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类包拉米虫和派琴虫感染的检测。

贝类派琴虫和单孢子虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据基因库中派琴虫和单孢子虫基因组的保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测派琴虫和单孢子虫的二重荧光定量PCR方法。该方法特异性好,对派琴虫和单孢子虫的检测敏感性分别达到400和40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对派琴虫和单孢子虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这2个原虫。对广西沿海的49份贻贝病料进行检测,结果派琴虫阳性率为16.3%,检测的派琴虫含量为2.38×106～9.21×102拷贝/μL;提示派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的荧光定量PCR方法可以用于贝类派琴虫的临床快速检测。该方法对单孢子虫检测的敏感性比派琴虫高,而49份贻贝病料未检出单孢子虫,提示需要进行更多临床样品的检测。