恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

【目的】构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒 ,并检测在大肠杆菌BL2 1/DE3中的表达情况。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因 (Pf332 )片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,并分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定。用DNAstar软件对FCC1/HN株与 3D7株Pf332的P332 R1、P332 R2片段进行同源性比较。由IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1/DE3中表达重组蛋白。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,大小分别为 489、42 9和 393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pGEX P332 R0、pGEX P332 R1、pGEX P332 R2重组质粒。序列分析结果显示 ,与 3D7株相比 ,FCC1/HN株P332 R1、P332 R2片段编码多肽分别缺少 2、4个相应的重复单元。在大肠杆菌BL2 1/DE3中表达出 3个重组蛋白 ,相对分子质量分别为 46、44和 42。【结论】扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,并在大肠杆菌BL2 1/DE3中成功表达。FCC1/HN株与 3D7株的P332 R1、P332 R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。

恶性疟原虫Pf332基因片段的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒的构建

目的 构建包含恶性疟原虫Pf332基因片段的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒。方法 从FCC1/HN株基因组DNA中PCR扩增Pf332基因片段 ,P332 -RO、P332 -R1和P332 -R2 ;用PCR扩增法合成鼠IgG轻链隹号肽的编码序列。用定向克隆法分别构建分泌型重组质粒pcDNA3 -s -P332 -R0、pcDNA3 -s -P332 -R1、pcDNA3 -s -P332 -R2和非分泌型重组质粒pcDNA3 -s -P332 -R0、pcDNA3 -s -P332 -R1、pcDNA3 -s -P332 -R2。阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332基因片段 ,P332 -R0、P332 -R1、P332 -R1,大小分别为 489、42 9和 393bp。用PCR扩增法合成 6 3bp的Balb/c小鼠IgG轻链信号肽的编码序列。酶切、PCR及测序鉴定表明获得了正确的含Pf332基因片段的分泌型、非分泌型重组质粒。结论 成功构建分别包含恶性疟原虫Pf332基因片段—P332 -R0、P332 -R1和P332 -R2的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒。

恶性疟原虫红内期Pf332抗原基因未知序列的测定及分析

测定恶性疟原虫红内期Pf332抗原 (Ag332 )基因的未知序列 ,并进行序列分析 .根据非洲恶性疟原虫Palo alto株Pf332基因的G1片段序列 ,设计 1对引物 ,从中国恶性疟原虫海南株 (FCC1 HN)基因组DNA中扩增出P332 1片段 .Pf332基因中经常出现SVTEEI短肽的编码序列 ,据此分别设计非特异的正、反义寡核苷酸引物 (NSP1、NSP2 ) ,应用低严谨PCR(LSPCR)分别扩增出P332 1邻近的未知序列片段P332 up1和P332 dow1.根据恶性疟原虫Palo alto株Pf332基因G1片段上、下游的G9和C1片段序列以及测定的P332 up1和P332 dow1序列 ,分别设计 2对特异引物继续扩增邻近的未知序列片段P332 up2和P332 dow2 .根据P332 dow2片段的 3'端序列 ,设计 2条特异引物分别与非特异引物NSP2行LSPCR和巢式PCR ,扩增出P332 dow2邻近的未知序列片段P332 dow3.对获得的Pf332基因片段进行序列测定 ,并用分子生物学软件辅助进行序列分析 .序列测定和拼接结果显示 ,共获得了连续 6 14 4bp的恶性疟原虫FCC1 HN株Pf332基因序列 .序列分析表明 ,所获得的 614 4bp序列位于Pf332基因的编码区内 ,不含内含子 ,编码 2 0 4 8个氨基酸残基 ,包含 5个氨基酸残基重复区 .对恶性疟原虫FCC1 HN株Pf332基因 6 14 4bp序列的测定和分析 。

Pf332抗原的结构和抗原表位的初步研究(英文)

目的 了解恶性疟原虫FCC1/HN株Pf332抗原 (Ag332 )的初级结构和潜在的抗原表位。方法 根据Pf332基因已知序列 ,合成 9对引物用于从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因片段。将扩增得到的 9个Pf332基因片段插入pMD 18T载体后测序。用DNAstar软件将测定的Pf332基因片段序列拼接出成完整的Pf332基因序列。分别用SAPS、Tmpred、SingalP和Blastn程序来分析Ag332的初级结构和序列同源性。将与Pf332基因的 95 95～ 10 0 83、10 339～ 10 76 7和 10 85 5～ 112 4 7位碱基对应的R0、R1和R2片段分别插入真核表达载体pcDNA3 S。将pcDNA3 S R0、pcDNA3 S R1和pcDNA3 S R2分别免疫Balb/c鼠 ,并通过免疫组化检测表达产物。通过ELISA和体外疟原虫生长抑制实验来鉴定DNA免疫所诱导的保护性免疫反应。结果 扩增到特异的 9个Pf332基因片段 ,并正确插入pMD 18T载体。序列测定和拼接结果显示 ,恶性疟原虫FCC1/HN株Pf332基因长 16 377bp ,编码 5 4 5 8个氨基酸 ,相对分子质量约 6 15 2 8ku。Ag332包含 17个高度简并的富谷氨酸重复序列 ,抗原中谷氨酸占 30 18%。恶性疟原虫FCC1/HN株和 3D7株Ag332的氨基酸残基同源性达 94 5 5 %。免疫组化检测显示R0、R1和R2在鼠肌肉组织中表达。分别免疫了pcDNA3 S R0、

恶性疟原虫膜蛋白Pf332-DBL区在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达恶性疟原虫膜蛋白Pf332-DBL区。方法采用PCR技术,扩增Pf332-DBL区基因序列,并插入到pPICZαA载体EcoRⅠ和XbaⅠ位点间,电转化至毕赤酵母X-33中,筛选阳性重组酵母,甲醇诱导表达,并通过亲和层析纯化重组蛋白,Western blot进行鉴定。结果获得1株阳性重组酵母;表达的重组蛋白相对分子质量约33000,诱导72h,目的蛋白的表达量最高,占上清蛋白总量的85%;纯化的重组蛋白浓度为800μg/ml,与抗His标签的鼠源单抗和抗Pf332-DBL单抗均可发生特异性反应。结论已成功地在毕赤酵母中表达了恶性疟原虫膜蛋白Pf332-DBL区,为下一步利用该蛋白进行亚单位疫苗的研制及其功能研究奠定了基础。

恶性疟原虫红内期PF332抗原基因未知片段的体外扩增与克隆

根据恶性疟原虫FCCI／NH株PF332基因片段5’端巳知序列，设计台成了一条特异引物(SP)；报据PF332基因的结构特点，又设计合成了一条非特异引物(NSP)。应用低严谨PCR技术(LSPCR)，从恶性疟原虫FCC1／FN株基因组DNA中扩增出一系列PF332基因未知片段。利用T-A克隆法将一560bp大小的片段克隆入测序用PMD-18T载体。限制性内切酶酶切及PCR扩增鉴定表明重组正确。

恶性疟原虫Pf332分子DBL、TM和WR功能区蛋白质的转运分析

目的分析恶性疟原虫Pf332分子的DBL、TM和WR 3个功能区蛋白质在虫体内的表达和分布以及与肌动蛋白的结合情况,探讨其在感染红细胞内的转运过程及功能,为进一步研究疟原虫侵入机制及筛选红内期疫苗候选抗原提供理论依据。方法将构建融有GFP基因的恶性疟原虫Pf332分子的Pf332DBL-GFP、Pf332TM-GFP和Pf332WR-GFP重组质粒分别转染到3D7虫株恶性疟原虫,通过活体荧光实时观察DBL、TM和WR蛋白质表达及其在染虫红细胞内的分布,运用间接免疫荧光共定位方法观察蛋白质DBL、TM和WR与肌动蛋白的结合情况。结果转染试验表明,重组DBL-GFP、TM-GFP和WR-GFP基因能在虫体中正常表达蛋白质,该蛋白均分布在染虫红细胞的纳虫泡内,但未能转运到红细胞的胞浆内。间接免疫荧光共定位表明恶性疟原虫Pf332分子的DBL、TM和WR等3个功能区蛋白质均未与肌动蛋白(β-actin)结合。结论 Pf332分子的DBL、TM和WR等3个功能区蛋白在单独表达后自身均不能发生跨膜反应,即不能通过虫体的纳虫泡膜。由此推测,Pf332分子在虫体内合成后很可能通过多个功能基团协同作用转运到红细胞膜部位。