2010—2018年云南中缅边境地区恶性疟原虫抗磺胺多辛⁃乙胺嘧啶药物基因多态性分析

目的分析云南中缅边境地区恶性疟原虫抗叶酸类药物磺胺多辛-乙胺嘧啶抗性基因的多态性和抗性回复突变趋势。方法收集2010—2018年中缅边境恶性疟病例滤纸血样品,巢式PCR扩增恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(pfdhps)基因,采用Geneious Prime软件比对测序结果,Microsoft Excel 2016和GraphPad prism 8.0.2软件分析突变频率和单体型分布差异,卡方检验分析抗性相关基因位点单核苷酸多态性特征和不同年份单体型分布差异,Haploview软件分析pfdhfr和pfdhps基因连锁不平衡情况。结果共收集中缅边境地区190份恶性疟样品,PCR扩增出pfdhfr 180份、pfdhps 178份。测序结果显示,pfdhfr和pfdhps均出现等位基因的多重感染,其中pfdhfr检出17个多重感染,突变位点分别位于第51、59、108、164位氨基酸密码子,其表型为51I/59R/108N/164L;pfdhps检出4个多重感染,突变位点分别位于第436、437、540、581位氨基酸密码子,其表型为436A/437A/540E\N/581G(“\”表示并列关系)。pfdhfr第N51I、C59R、S108N、I164L位点的突变率分别为57.8%(108/187)、90.1%(172/191)、93.3%(168/180)、59.6%(109/183);pfdhps第S436A\C、A437G、K540E\N、A581G位点抗性突变率分别为54.7%(99/181)、86.5%(154/178)、84.9%(152/177)、28.7%(51/178)。pfdhfr单体型主要集中在三点、四点突变型(51I59R108N/59R108N164L、51I59R108N164L),分别占44.9%(84/187)和36.9%(69/187)。pfdhfr和pfdhps野生型在2010年均未检出。2011年的pfdhfr三点、四点突变单体型(同上)分布频率分别为35.9%(23/64)、37.5%(24/64),均小于2010年的46.2%(30/65)、49.23%(32/65)(P<0.05),与2014—2018年的53.4%(32/58)、22.4%(13/58)比较差异有统计学意义(P<0.05)。2014—2018年的pfdhps三点突变单体型(436A\C437G540E\N,437G540E\N581G)分布频率为62.1%(36/58),小于2010年的82.3%(51/62)和2011年的78.7%(48/61)(均P<0.05)。连锁不平衡分析显示,pfdhfr C59R与S108N基因关联性强(D’=1,r2=0.8),pfdhps S436A与A581G关联性强(D’=1,r2=0.6),且S108N与K540E存在较强关联性(D’=0.8,r2=0.2)。结论云南中缅边境恶性疟原虫pfdhfr和pfdhps基因的抗性分子突变单体型仍是优势基因,且随着停药时间延长突变频率逐渐降低。

河南省自赤道几内亚输入的恶性疟原虫抗药性基因多态性分析

目的分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征。方法收集河南省2012—2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Kelch 13螺旋体(PfK13)基因、恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Pfcrt)基因、恶性疟原虫多药物抗性基因1(Pfmdr1)、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(Pfdhps)基因,琼脂糖凝胶电泳后进行双向测序。获得的基因序列通过MEGA7软件与参考基因组进行比较获得突变位点信息,参考基因组来自GenBank的恶性疟原虫3D7野生虫株(GenBank登录号分别为PF3D7_1343700、PF3D7_0709000、PF3D7_0523000、PF3D7_0417200和PF3D7_1324800)。使用SPPS 21.0软件对数据进行统计学分析。结果2012—2019年,河南省共报告输入性疟疾病例1522例,其中自赤道几内亚输入病例117例,包括恶性疟病例97例、卵形疟病例16例、间日疟和三日疟病例各1例、恶性疟原虫/三日疟原虫混合感染和恶性疟原虫/卵形疟原虫混合感染病例各1例。测序获得91份恶性疟原虫样品的PfK13基因序列,基因突变率为8.8%(8/91);突变样品中共检测出7个非同义突变位点和3个同义突变位点,其中非同义突变位点分别为M476I混合型(混)、A481V混、A564E混、P574L混、A578S、V589I和N609I混,同义突变位点分别为G625G、N664N和C469C。测序获得91份恶性疟原虫样品的Pfcrt基因序列,基因突变率为18.7%(17/91);检测出3种Pfcrt基因型,分别为野生型C72V73M74N75K76(81.3%,74/91)、突变型C72V73I74E75T76(12.1%,11/91)和混合型C72V73M/I74N/E75K/T76(6.6%,6/91)。测序获得92份恶性疟原虫样品的Pfmdr1基因序列,基因突变率为77.2%(71/92);检测出3个突变位点,分别为N86Y(41.3%,38/92)、Y184F(75.0%,69/92)和D1246Y(1.1%,1/92),其中N86Y突变率从2012年的68.8%(11/16)下降到2016年的11.1%(1/9)(χ2=11.58,P<0.05);检测出5种Pfmdr1基因型,分别为野生型N86Y184D1246(22.8%,21/92),单基因突变型Y86Y184D1246(1.1%,1/92)、N86F184D1246(34.8%,32/92)、N86Y184Y1246(1.1%,1/92)和双重突变型Y86F184D1246(40.2%,37/92)。测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhfr基因序列,基因突变率为96.7%(87/90);检测出3个突变位点,分别为N51I(91.1%,82/90)、C59R(93.3%,84/90)和S108N(96.7%,87/90);检测出5种Pfdhfr基因型,分别为野生型N51C59S108(3.3%,3/90),单基因突变型N51C59N108(2.2%,2/90),双重突变型I51C59N108(1.1%,2/90)、N51R59N108(3.3%,3/90)和三重突变型I51R59N108(90.0%,81/90)。测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhps基因序列,基因突变率为97.8%(88/90);检测出6个突变位点,分别为I431V(8.9%,8/90)、S436A(27.8%,25/90)、A437G(92.2%,83/90)、K540E(3.3%,3/90)、A581G(1.1%,1/90)和A613S(2.2%,2/90);检测出8种Pfdhps基因型,分别为野生型I431S436A437K540A581A613(2.2%,2/90),单基因突变型I431A436A437K540A581A613(5.6%,5/90)、I431S436G437K540A581A613(66.7%,60/90),双重突变型I431A436G437K540A581A613(10.0%,9/90)、I431S436G437E540A581A613(3.3%,3/90),三重突变型V431A436G437K540A581A613(8.9%,8/90)、I431A436G437K540G581A613(1.1%,1/90)和I431A436G437K540A581S613(2.2%,2/90)。89份恶性疟原虫样品的Pfdhfr和Pfdhps基因同时测序成功,其中84例(94.4%)同时发生双基因突变,四重突变体I51R59N108⁃G437占比最高(64.0%,57/89)。结论自赤道几内亚输入的恶性疟原虫样品中检出多个PfK13基因突变位点,其中M476I和P574L已被证实与青蒿素类药物抗性相关;随着氯喹的停用,与青蒿素配伍药物抗性相关的Pfcrt和Pfmdr1基因突变率呈下降趋势;恶性疟原虫对磺胺多辛⁃乙胺嘧啶药物抗性水平多为“部分抗性”,未检出“超级抗性”样品。

中缅边境地区恶性疟原虫dhfr和dhps基因多态性分析

目的 分析中缅边境地区恶性疟原虫dhfr和dhps基因多态性。方法 收集2001-2012年中缅边境中国云南西双版纳州景洪市、缅甸克钦邦拉咱市和缅甸掸邦第二特区勐冒县恶性疟患者滤纸血样本175份,采用巢式PCR法分别扩增恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因(Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase gene,pfdhfr)第51-164位点片段和二氢蝶酸合成酶基因(Plasmodium falciparum dihydropteroate synthase gene,pfdhps)第436-613位点片段,并对扩增产物进行测序分析。结果 共检测到恶性疟原虫pfdhfr基因4个突变位点(N51I、C59R、S108N和I164L)和7种基因型,3个地区pfdhfr基因均存在四重突变型(IRNL),其中云南景洪市2001年和2006年IRNL分别占26.7%和28%,缅甸拉咱市2001年、2007年和2012年分别占35%、40%和60%,缅甸勐冒县2009年占比为40%。pfdhfr基因野生型,云南景洪市2001年占比23.3%,2006年未检测到野生型,以二重突变型(NRNI)为主,占44%;缅甸拉咱市2001年占比10%,单重突变型率(NRSI)5%,双重突变型率(IRSI,NRNI)10%,三重突变型率(IRNI,NRNL)40%,2007年除四重突变外(40%),三重突变型率(NRNL)和二重突变型率(NRNI)均为30%,2012年三重突变以IRNI型为主占25%;缅甸勐冒县2009年pfdhfr基因野生型比例较高,占45%,三重突变型率(NRNL和IRNI)占12.5%。共检测到pfdhps基因4个突变位点(S436A/F,A437G,K540E/N和A581G)和14种基因型,其中云南景洪市2001年样本中pfdhps基因未发现三重突变,以二重突变型(SAEG)为主,占53.3%,2006年出现了三重突变型(FAEG),占8%,单突变型率(AAKA)40%;缅甸拉咱市pfdhps基因三重突变型率(FAEG)2001年、2007年和2012年分别为5%、35%和37.5%,单突变型(SGKA,SAEA,SAKG)仅在2001年样本中检测到,占比30%,2007年(SAEG,FGKA,FAEA,AAEA)及2012年(SAEG,FAKG,FGKA,AAEA)中双重突变型率分别占60%和55%;缅甸勐冒县2009年样本中pfdhps基因三重突变型率(FAEG)为27.5%,无野生型及单突变型,二重突变型率(AAEA和FGKA)为50%。结论 中缅边境3个地区pfdhfr基因和pfdhps基因突变程度均较高,提示该地区恶性疟原虫对磺胺多辛-乙胺嘧啶药物存在抗性,可为中缅边境地区恶性疟的防治提供参考。