恶性疟原虫海南分离株pfmdr1基因与氯喹抗性的相关性分析

目的了解海南省恶性疟原虫pfmdr1基因同氯喹抗性的关系。方法采用套式PCR技术特异性扩增pfmdr1基因含有编码第86位、1042位和1246位氨基酸的基因片段,并对扩增产物进行RFLP分析。结果42个样本中,pfmdr1第86位氨基酸均未发生突变,即86位氨基酸是野生型的Asn,而不是突变型的Tyr。第1246位氨基酸发生突变的样本共有7个,全部为抗性虫株。第1042位点PCR扩增结果阳性的37个样本中突变的样本共有10个,其中9个为抗性虫株,一个为敏感虫株。结论我国海南省恶性疟原虫氯喹抗性产生与pfmdr186位氨基酸基因多态性无关,但第1042和1246位氨基酸的突变更易在抗性虫株中检出。

海南恶性疟原虫分离株Pfcrt和Pfmdr1基因点突变的研究

目的分析海南省恶性疟原虫分离株氯喹抗性转运蛋白编码基因(Pfcrt)及其P-糖蛋白同系物1(Pgh1)编码基因(Pfmdr1)的点突变特征,为探讨抗性分子标记用于氯喹抗性监测提供参考。方法采用巢式PCR(nested-PCR)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法,检测Pfcrt基因编码第76位氨基酸的密码子和Pfmdr1基因编码第86、1246位氨基酸的密码子发生点突变情况。按世界卫生组织(WHO)推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果检测的36份血样中,28份成功扩增Pfcrt基因,导致第76位氨基酸由赖氨酸(K)变为苏氨酸(T)的突变型占64.3%,混合型占14.3%,野生型占21.4%;29份成功扩增Pfmdr1基因,导致第86位氨基酸由天冬酰胺(N)变为酪氨酸(Y)的突变型占3.4%,混合型占6.9%,野生型占89.7%。未发现编码第1246位氨基酸的密码子发生点突变。体外氯喹敏感试验结果显示,72.2%(26/36)分离株存在抗性。治疗前恶性疟原虫Pfcrt76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性与敏感株中的差异有统计学意义(P<0.05),而Pfmdr1点突变发生率在氯喹抗性与敏感株中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论恶性疟原虫Pfcrt基因76T可以作为监测氯喹抗性的一个分子标记。

输入性恶性疟原虫耐药相关基因Pfcrt和Pfmdr1单倍型及突变分析

目的了解目前山东省输入性恶性疟原虫抗药性基因Pfcrt和Pfmdr1的单倍型,分析突变基因型及其分布情况。方法根据恶性疟原虫Pfcrt和Pfmdr1基因序列设计套式PCR引物,对采自全省非洲务工返乡的输入性恶性疟感染者血样扩增,并对其产物进行基因测序和序列对比分析。结果 68例样本Pfcrt基因第72~76位点和Pfmdr1基因第86、1 042和1 246位点目的片段全部成功扩增和测序。Pfcrt基因中69.12%为野生单倍型CVMNK,30.88%为突变单倍型,突变型包括CVIET、CVIDT及混合型,其中CVIET数量最多。Pfmdr1基因中69.12%为野生单倍型NND,30.88%为突变单倍型,即YND及混合基因型。6个非洲输入来源国样本中,除几内亚Pfcrt基因全部为野生型外,其它国家Pfcrt和Pfmdr1基因均有突变型存在。5例样本Pfcrt和Pfmdr1基因共同表现为突变单倍型。结论山东省输入性恶性疟Pfcrt和Pfmdr1基因突变单倍型具有多样化特征。Pfcrt和Pfmdr1突变型比例均低于野生型,提示目前该省流行的输入性恶性疟未出现严重的氯喹耐药性。

氯喹抗药性与相关基因Pfmdr1

抗疟药氯喹作为安全、有效、廉价的一线抗疟药物被广泛使用。随着世界各地恶性疟原虫株氯喹抗性的产生,氯喹抗药性的机制研究已成为疟疾研究的重点之一。本文就有关氯喹抗药性与相关基因序列Pfmdr1的研究进展作一综述。

中缅边境恶性疟原虫pfmdr1基因多态性及pfmsp1等位基因分型研究

目的分析中缅边境恶性疟原虫多抗药基因1（Plasmodium falciparum multidrugresist．ancel，pfmdr1）基因编码蛋白86位点多态性及裂殖子表面蛋白1（P．falciparu mmerozoite surface protein1gene，pfmsp1）等位基因的分型特征。方法采用chelex-100法提取DNA，PCR扩增pfmdr1基因编码蛋白86位点及pfmsp1基因第2区与第3区部分片段，并对其进行DNA测序，对扩增片段基因的结构、同源性进行分析。结果检钡4的50份血样中，49份成功扩增pfmdr1基因，49份在第25位氨基酸均发生缺失，且在第27—29位氨基酸由STA都突变为EYR，9份在第35位氨基酸缺失，第86位氨基酸均未发生点突变。50份恶性疟患者样本中有49份共扩增出72个pfmsp1基因片段，以MAD20型为主导型占93．88％，K1、R033型为次之，并存在不同基因株混合感染现象。结论中缅边境恶性疟原虫株pfmdr1基因第86位氨基酸点无突变，pfrrup1存在MAD20型、K1型和R033型3种等位基因型，以MAD20型为优势虫株。

酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性的研究

目的研究酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性,及其增效机制。方法恶性疟原虫氯喹抗性株(FccSM1/yN株)取自云南省思茅地区恶性疟患者静脉血,经同步化处理,用新鲜血将红细胞感染率调至0.5%～1.0%,红细胞压积与培养基体积比(红细胞比容)为1∶9,混匀。制备氯喹药板及氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板。氯喹药板自上而下每行氯喹终浓度依次为0.3125～2560nmol/L,呈2倍递增。氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板,是在氯喹药板基础上加入酮替芬(或赛庚啶),每行10孔自左至右终浓度依次为9.77～5000nmol/L,呈2倍递增,每块药板均设A行空白对照。每孔加混匀血样50μl,37℃培养34h,镜检计数每200个疟原虫中含3个核以上裂殖体数,计算氯喹单药及各配伍组对恶性疟原虫的半数抑制浓度(IC50),以及酮替芬(或赛庚啶)提高氯喹活性的指数(AEI)。选择AEI值较高的配伍组,进行增效时序性研究。当氯喹对虫体作用0～10h分别加入酮替芬(或赛庚啶),34h后检测和计算各时间段IC50及AEI。选择氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)最佳配伍剂量,培养恶性疟原虫20h,提取总RNA,用实时荧光定量PCR(real-timePCR)分析药物作用前后恶性疟原虫氯喹抗性转移基因(pfcrt)和多药抗性基因(pfmdr1)表达水平。结果0.3125～2560nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为74.53nmol/L,AEI为0.42;氯喹/赛庚啶的IC50为89.70nmol/L、AEI为0.30。5nmol/L氯喹作用6～7h加入625nmol/L酮替芬(或赛庚啶),增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为67.70nmol/L、AEI为0.47;氯喹/赛庚啶的IC50为81.53nmol/L、AEI为0.37。5nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,作用20h,氯喹/酮替芬可使pfcrt基因表达水平升高91%,而氯喹/赛庚啶可使pfmdr1基因表达水平下降14%。结论体外氯喹与适量的酮替芬(或赛庚啶)配伍,能增强恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹的反应性。氯喹对虫体作用6～7h加入酮替芬(或赛庚啶)增效作用显著。该增效作用与pfcrt基因和pfmdr1基因的表达水平有关。

境外输入性恶性疟原虫药物抗性基因多态性分析

目的了解河南省输入性恶性疟原虫相关抗性基因的突变情况。方法采集河南省2016年自非洲劳务返乡的131例输入性恶性疟患者血样,提取DNA,采用Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因序列引物进行巢式PCR扩增并测序,对测序结果进行序列比对,分析基因突变情况。结果 131例输入性恶性疟患者自19个非洲国家务工返乡。131份血样均扩增出Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因片段。其中Pfdhfr基因51,59和108位点氨基酸双突变NRNI型占2.29%,ICNI型占10.69%,三突变IRNI型占85.49%,野生型占1.53%,未见四突变。Pfmdr1基因86突变率分别为9.16%,K13突变率为11.45%,共15份血样检测到9个位点突变。结论 2016年河南省输入性恶性疟原虫Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因均有不同程度的突变,其中Pfdhfr基因三突变型所占比例较高,K13基因未检测到与青蒿素抗性相关的突变。

中缅边境地区恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的多态性分析

目的 分析中缅边境地区恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的多态性。方法 收集2001-2012年中国云南省西双版纳州景洪市、缅甸克钦邦拉咱市和掸邦第二特区勐冒县恶性疟病例滤纸血标本175份,采用巢式PCR法扩增恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter gene,pfcrt)基因第72-76位点片段和多药耐药基因1(Plasmodium falciparum multidrug resistance gene 1,pfmdr1)基因第86-1246位点片段,并对扩增产物测序分析。结果 共检测到pfcrt基因5种突变型(CVIEK,CVIDK,SVMNT,CVIET,CVIDT),该3个地区均以三重突变型(CVIET)为主,其中,中国云南西双版纳CVIET由2001年的76.7%上升至2006年的100%,缅甸拉咱市由2001年的75%上升至2007年的95%,但2012年又下降至77.5%,缅甸勐冒县2009年该突变型占比为67.5%。共检测到pfmdr1基因5种单突变型(N86Y,E130K,Y184F,S1034C,F1226Y)和2种双重突变型(N86Y/F1226Y,Y184F/F1226Y),其中2001年西双版纳pfmdr1基因野生型占36.7%,N86Y和Y184F突变率均为20%,F1226Y突变率为16.7%,而2006年以F1226Y突变为主占40%,且检测到二重突变型(N86Y/F1226Y和Y184F/F1226Y)占8%;缅甸拉咱市pfmdr1基因Y184F突变率从2001年的25%升高至2007年的35%和2012年的37.5%,该3年中野生型分别占65%、40%和55%;2009年缅甸勐冒县pfmdr1基因野生型比例为47.5%,Y184和N86Y单突变型分别为27.5%和25%。结论 中缅边境恶性疟原虫pfcrt基因均以三重突变型(CVIET)为主,氯喹抗性均较高,可为中缅边境地区恶性疟的防治提供参考。