乌头碱影响KB_(V200)细胞Pgp蛋白表达的组化实验

目的:通过观察Pgp蛋白表达的细胞阳性率探讨乌头碱抗KBV200细胞耐药机制。方法:以免疫组化法,分别测定6.25μg/mL、12.5μg/mL乌头碱作用后的KBV200细胞Pgp蛋白阳性表达率。结果:对照组Pgp蛋白表达的阳性细胞为96%;而6.25μg/mL、12.5μg/mL乌头碱作用后Pgp蛋白表达的阳性细胞率分别为83%、30%。结论:乌头碱能够降低KBV200细胞Pgp蛋白高表达,部分逆转KBV200细胞耐药性。

风湿性心脏瓣膜病房颤肺静脉组织学及pgp9.5蛋白分布研究

目的:探讨风湿性心脏瓣膜病合并房颤病人肺静脉组织学及pgp9.5(product gene protein 9.5)蛋白表达的变化特点。方法:选取风湿性心脏瓣膜病行瓣膜置换术病人26例,术中收集右上肺静脉标本。将病人分为房颤心律组(n=14),窦性心律组(n=12),对肺静脉标本行HE染色及pgp9.5蛋白Envension免疫组织化学染色。结果:与窦性心律组相比,房颤组心肌袖部心肌细胞肥大,肌束间间隙较大,排列更紊乱;脂肪垫及心肌组织有大量表达pgp9.5蛋白的细胞。结论:风湿性心脏病合并房颤致肺静脉心肌袖部心肌细胞肥大,间隙增宽;免疫组化染色表明肺静脉组织有大量表达pgp9.5蛋白的细胞存在。

SiO_(2)-Pickering乳液佐剂增强沙眼衣原体Pgp3蛋白免疫效果

目的优化二氧化硅(SiO_(2))Pickering(SPE)乳液佐剂,研究其对沙眼衣原体(Ct)Pgp3蛋白的免疫增强效应,为预防Ct感染性疾病提供实验依据。方法优化SiO_(2)质量浓度、水油比及超声功率,超声乳化制备SPE佐剂。30只小鼠均分为SPE+Pgp3组(Pgp3蛋白和SPE混合免疫)、Pgp3组(Pgp3蛋白单独免疫)和PBS组。ELISA检测各组小鼠血清抗体水平和脾细胞上清细胞因子水平,流式细胞术检测脾细胞γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)水平。结果SPE最优制备条件为超声功率337 W、水油比10∶2、SiO_(2)质量浓度1 g/L,最优条件下SPE直径为(300.12±44.26)nm,聚合物分散性指数为0.33±0.12。除PBS组外,其他组均检测到了特异性抗体,SPE+Pgp3组总抗体IgG及其亚类IgG1、IgG2a抗体水平高于Pgp3组,且以IgG2a升高为主(P<0.05)。SPE+Pgp3组、Pgp3组脾细胞IFN-γ和刺激指数高于PBS组,且SPE+Pgp3组高于Pgp3组(P<0.05);IFN-γ主要由CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞分泌。各组IL-4含量均较低。结论SPE乳液佐剂具有良好的佐剂效应,能有效增强Pgp3蛋白体液免疫和细胞免疫,且可优势诱导Th1型免疫反应。

肺癌组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白水平检测及其临床价值探讨

背景与目的:肺癌发病机制具有多样性,但一经确认,往往已错过最佳治疗时机,本文通过探讨肺癌组织和外周血中抑癌基因(p53)、蛋白基因产物(PGP9.5)、转录因子(SOX2)、肿瘤相关基因编码蛋白(GAGE7)、解旋酶(GBU4-5)和黑色素瘤抗原(MAGE A1)蛋白水平的相关性,同时分析其在肺癌诊疗中的应用价值。方法:回顾并分析2018年5月—2020年5月在复旦大学附属肿瘤医院确诊的100例肺癌患者的病历资料,临床TNM分期Ⅰ期25例,Ⅱ期45例,Ⅲa期30例;非小细胞肺癌80例,小细胞肺癌20例;取手术切除的肿瘤组织和癌旁组织,采用免疫组织化学染色法检测上述6种蛋白的水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)法检测其基因表达,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测外周血中6种蛋白的抗体阳性情况。结果:肿瘤组织中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05);将其与肿瘤的临床病理学特征进行相关分析发现,肿瘤组织和外周血中的p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平与肿瘤TNM分期和分化级别有关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理学类型无关(P>0.05)。肿瘤组织中6种蛋白的表达水平与外周血清表达具有较好的一致性(P>0.05)。结论:肺癌肿瘤组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表达阳性与肿瘤TNM分期及分化级别密切相关。

环孢霉素A逆转Pgp多药耐药机理的研究

目的 探讨环孢霉素 A (Cs A)逆转糖蛋白 Pgp耐药细胞株 K5 6 2 /ADR耐药的机理。方法 采用RT- PCR、荧光法、MTT和共聚焦激光扫描显微镜等方法 ,研究 Cs A对柔红霉素 (DNR)在 Pgp耐药细胞株 K5 6 2 /ADR蓄积、毒性及分布的影响。结果 Cs A可明显增加 DNR在耐药细胞内的蓄积 ,恢复 DNR在耐药细胞核、浆的弥漫分布 ,提高耐药细胞对 DNR的敏感性。结论 Cs A通过增加耐药细胞内化疗药物含量和逆转化疗药物异常分布的作用 ,恢复耐药细胞对化疗药物的敏感性。

多药耐药基因PgP、ToPo-Ⅱ、GST-π与Ki-67在肺癌中的表达及其临床病理学意义

目的:探讨耐药基因PgP、ToPo-Ⅱ、GST-π和核增殖细胞抗原Ki-67在肺癌中的表达及其临床病理学意义。方法:应用免疫组织化学(SP法)检测58例肺癌中PgP、ToPo-Ⅱ、GST-π和增殖细胞核抗原Ki-67的表达情况。结果:PgP、ToPo-Ⅱ、GST-π在58例肺癌组织中的阳性率分别为17.1%、79.1%、72.3%;其中ToPo-Ⅱ在鳞癌和小细胞癌中的表达明显高于腺癌组织(P<0.05),PgP、GST-π在三种癌中的表达无差异;三种耐药基因的共表达在淋巴结有转移中的表达明显高于无转移组(P<0.05),而与癌症类型无相关性;Ki-67的表达与三种耐药基因无明显相关。结论:肺癌的耐药与多种耐药基因蛋白介导有关,联合检测肺癌中多种耐药基因蛋白的表达,对于临床选择合理的化疗药物及防止耐药有重要意义。

乳腺癌组织中CerbB-2、Ki-67、Pgp、GST-π、TopoⅡ的表达变化及意义

目的观察乳腺癌组织中CerbB-2、Ki-67、Pgp、GST-π、TopoⅡ的表达变化,并探讨其临床意义。方法采用免疫组化法检测170例乳腺癌组织中CerbB-2、Ki-67、Pgp、GST-π、TopoⅡ,分析其与乳腺癌临床病理指标的关系。结果乳腺癌组织中CerbB-2、Ki-67、Pgp、GST-π、TopoⅡ的阳性表达率分别为51.76%、78.24%、43.53%、62.35%、62.35%。CerbB-2的表达与乳腺癌直径及淋巴结转移有关(P均<0.05),Ki-67、Pgp的表达与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移有关(P均<0.05),TopoⅡ的表达与乳腺癌组织学分级有关(P<0.05)。Ki-67的阳性表达与CerbB-2、TopoⅡ呈明显正相关(r=0.176、0.355,P均<0.05),Pgp阳性表达与TopoⅡ呈正相关(r=0.168,P<0.05)。结论乳腺癌组织中CerbB-2、Ki-67、Pgp、GST-π、TopoⅡ均有较高表达;除GST-π外,均与乳腺癌的发展有关,是判断其预后的重要指标。

耐抗癫痫药大鼠模型脑内P-糖蛋白的表达

目的：通过耐丙戊酸钠（VPA）、耐卡马西平（CBZ）大鼠惊厥模型探讨癫痫耐药机制。方法：采用大鼠腹腔注射戊四氮（PTz）21d的点燃方法，建立大鼠惊厥模型。在此基础上分别以CBZ及VPA灌胃14d，建立耐CBZ及耐VPA大鼠惊厥模型。实验分4组：正常对照组、惊厥对照组、耐CBZ组及耐VPA组，每组8只鼠。以惊厥潜伏期和Racine行为学分级作为评定药效指标。采用免疫组化法检测大鼠脑内P-糖蛋白（Pgp）的表达变化；统计分析各组大鼠脑内Pgp表达量，探索癫痫大鼠的耐药机制。结果：①24只大鼠在连续腹腔注射PTZ21d达点燃标准，成功建立惊厥模型；②取16只惊厥大鼠分两组各灌胃CBZ及VPA14d后，两组大鼠惊厥潜伏期（5．84士2．94和6．23土2．57min）较惊厥对照组的惊厥潜伏期（3．32±1．83min）显著延长（P〈0．01），提示耐CBZ及耐VPA模型制备成功；③惊厥对照组PgP的表达（12．40±10．35）比正常对照组（1．62±0．85）增高，差异有统计学意义（P〈0．01）；耐CBZ组（38．67±17．28）及耐VPA组大鼠的PgP的表达（42．33±15．54）较惊厥对照组（12．40±10．35）增高，差异有显著意义（P〈0．01）；而耐CBZ组与耐VPA组之间PgP的差别则无统计学意义（P〉O．05）。结论：①大鼠腹腔注射PTz21d，建立惊厥模型，再进一步分别灌胃CBZ及VPA14d，成功建立耐CBZ及耐VPA模型；②CBZ和VPA可显著诱导Pgp的表达，而长期惊厥发作对其表达也可能有一定的诱导Pgp表达的作用。

大鼠上颌第一磨牙正畸移动中牙周膜神经PGP9.5的表达

目的:建立大鼠正畸牙移动模型,观察PGP9.5在牙周膜(PDL)神经中的表达及变化,探讨正畸力转化成神经元的反应的细胞调控机制。方法:成年雄性SD大鼠25只,随机分为5组:加力0、3、7、14、21天组,每组5只。上颌第一磨牙(URM1)施加50g近中向的拉力,按实验期限,分别取不同组大鼠含磨牙及其周围牙槽骨的组织块切片,进行PGP9.5免疫组化染色。镜下观察牙齿压力侧牙周膜神经纤维PGP9.5免疫阳性的变化情况,并进行灰度值分析、统计学方差分析和t检验。结果:压力侧的神经纤维的密度增加。在第7天牙槽骨表面出现类骨质的沉积;第21天根吸收陷窝处可见免疫阳性的牙周神经纤维。第3、7天牙周膜神经纤维PGP9.5的表达最强(P<0.05),之后神经的表达开始下降,牙周膜神经密度也逐渐恢复。结论:正畸加力使大鼠牙周膜神经中PGP9.5表达增强,PGP9.5调控神经肽的合成和分泌,可能是神经元细胞调控的重要机制。牙周膜神经在调节骨细胞活性和促进类骨质的形成,以及牙根吸收和修复等过程中可能也发挥重要作用。

低频重复经颅磁刺激对氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠海马CA3区PGP、MRP1、MVP表达的影响

目的研究低频重复经颅磁刺激(rTMS)对氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠海马CA3区P-糖蛋白(PGP)、多药耐药相关蛋白(MRP)1及主穹隆蛋白(MVP)表达水平的影响。方法 60只大鼠随机分为对照组,模型组,假刺激组,治疗组,每组15只。采用氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射构建癫痫大鼠模型,治疗组采用rT MS治疗,比较各组治疗过程中癫痫发作次数及CA3区PGP、MRP1及MVP的表达水平。结果治疗组癫痫发作频率低于模型组及假刺激组(P<0.05)。治疗组PGP、MRP1及MVP表达水平显著低于模型组及假刺激组(P<0.05),较对照组显著升高(P<0.05)。结论低频rTMS可抑制模型大鼠海马CA3区PGP、MRP1及MVP过度表达,低频rTMS的抗痫作用可能与之有关。

RNA干扰逆转人胃癌细胞多药耐药的研究

目的:研究RNA干扰沉默多药耐药(multidrug resistance,MDR)基因对胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-Fu生长的影响。方法:构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-FU,噻唑蓝(MTT)法检测耐药细胞对5-Fu的敏感性,实时荧光定量PCR(Real-time-PCR)检测MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况。结果:与RNAi-control组和normal组相比,RNAi-MDR1组细胞干扰质粒细胞的IC50明显降低,为2.104±0.242(P<0.05),敏感性的相对逆转率为76.8%;MDR1 mRNA表达明显下调(P<0.05);P-gp的表达水平降低(P<0.05);凋亡率明显升高至(5.757±0.684)%。结论:应用RNA干扰有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,增强了BGC-823/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,为寻找逆转胃癌细胞多药耐药有效方法奠定了基础。

D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3的克隆、表达、鉴定及其免疫原性初探

目的获得D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3基因及其蛋白，并鉴定其免疫原性。方法PCR扩增目的基因，将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1中，连接产物转化入大肠埃希菌DH5c~，提取质粒进行酶切、测序、PCR鉴定。再将重组质粒转化人大肠埃希菌BL21并诱导表达，Western印迹鉴定目的蛋白，谷胱甘肽巯基转移酶（GST）磁珠纯化pgp3-GST融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫新西兰家兔，Western印迹检测抗体与pgp3蛋白的结合，酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗体效价。结果克隆目的基因序列长度为795bp，与基因库中一致，Western印迹显示目的蛋白相对分子质量为54000，并得到纯化蛋白。所得兔血清可识别pgp3蛋白，ELISA检测多克隆抗体效价达1：25600。结论成功表达具有强免疫原性的pgp3-GST融合蛋白，为进一步研究奠定基础。

沙眼衣原体质粒蛋白pgp3多克隆抗体的制备及鉴定

目的表达并纯化D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3，制备鼠源性多克隆抗体。方法诱导表达pgp3蛋白，经谷胱甘肽-S-转移酶（GST）磁珠纯化后免疫BALB／c小鼠，制备多克隆抗体，Western印迹、细胞免疫荧光鉴定抗体的特异性，间接ELISA法测定抗体效价。结果得到纯化的pgp3蛋白，获得鼠源性多克隆抗体，经Western印迹和细胞免疫荧光鉴定抗体可特异性结合pgp3蛋白，ELISA测定所得抗体效价为1：819200。结论成功制备具有高效价、高特异性的抗pgp3多克隆抗体。

用^(99)Tc^m-MIBI在体外评价肿瘤细胞多药耐药逆转剂逆转细胞多药耐药的效果

通过观察99Tcm-MIBI细胞内摄取变化探讨了单独或低剂量联合应用多药耐药逆转剂逆转肿瘤细胞多药耐药的效果,期望为进一步解决临床恶性肿瘤化疗面临的问题提供实验依据。选择人类髓系白血病K562细胞及其耐药细胞系K562/D各2×106个,分别加入8 MBq99Tcm-MIBI,观察不同时间不同浓度多药耐药逆转剂环孢菌素A(CsA0.1～0.4 mg/L)和/或维拉帕米(Ver 2.5～10 mg/L)存在时,K562细胞及K562/D细胞对99Tcm-MIBI摄取变化。结果显示:①不同浓度Ver或CsA存在时,K562细胞99Tcm-MIBI摄取略有增加,但差异无显著性(P>0.05);K562/D细胞对99Tcm-MIBI的摄取均明显增加,但不同浓度Ver间及不同浓度CsA间,摄取增加的差异没有显著性(P>0.05)。②2.5 mg/L Ver及0.1 mg/L CsA同时加入K562细胞系中,60 min时99Tcm-MIBI摄取率为0.303±0.076,增加率为183%,接近单独应用Ver(10mg/L)或单独应用CsA(0.4 mg/L)。这说明低剂量逆转剂联合应用能达到与单一较大剂量应用逆转剂相似的效果,为临床逆转Pgp介导的多药耐药提示新的信息。

鼠肺炎沙眼衣原体质粒蛋白pgp5的克隆表达鉴定及免疫原性分析

目的获取鼠肺炎沙眼衣原体(Chlamydia muridarum)质粒蛋白pgp5的基因及纯化的蛋白并鉴定其免疫原性。方法设计引物,PCR扩增目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET28a中,然后将重组质粒转化入大肠杆菌E.coli DH5α中,并用PCR扩增及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。再将重组质粒转化入感受肽Rosetta(DE3)并诱导表达,用镍柱纯化pgp5-his融合蛋白。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,Western blot、细胞免疫荧光方法检测抗体与pgp5蛋白的结合。结果所获得的pgp5基因片段经测序长度为795 bp,检索确认其序列与GeneBank一致。十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹实验均显示获得相对分子质量约29 000的纯化蛋白。ELISA检测多克隆抗体效价达1∶100 000。细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与体外培养的鼠肺炎沙眼衣原体特异性结合。结论成功表达pgp5-his融合蛋白,并制备了高效价、高特异性的抗pgp5抗体,为进一步研究奠定了基础。

反义寡核苷酸对多药抗性基因表达影响的研究

多药抗性现象是肿瘤有效化疗的主要障碍 ,其中 mdr1基因过量表达产生膜蛋白 Pg P是最关键的一种。利用该多药抗性表型标志建立了 ELISA法定量检测 mdr1的表达水平 ,并用反义寡核苷酸对基因的表达进行调控。结果表明天然寡核苷酸在 Lipofectin的介导下能一定程度地抑制 Pg

子宫内膜异位症腹腔液IL-6及在位子宫内膜蛋白基因代谢产物9.5与疼痛的关系

目的:探讨子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)在位内膜中的神经纤维蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)及腹腔液白介素(IL)-6的表达及与EMs疼痛的关系。方法:选取住院行腹腔镜手术的EMs患者60例,分为无痛组27例[视觉模拟法(VAS)评分为0]和疼痛组33例(VAS评分>0),其中疼痛组分为轻度疼痛9例,中度疼痛10例,重度疼痛14例。并与同期行腹腔镜手术的35例子宫肌瘤患者(子宫肌瘤组)进行对比研究。通过检测EMs组和子宫肌瘤组患者腹腔液IL-6及在位子宫内膜PGP9.5,进行疼痛相关性分析。结果:腹腔液IL-6含量EMs组显著高于子宫肌瘤组(P<0.01);其中EMs患者中疼痛组高于无痛组(P<0.01),重度疼痛组高于轻、中度疼痛组(P<0.05),PGP9.5阳性率表达EMs组显著高于子宫肌瘤组(P<0.01),其中EMs患者中疼痛组高于无痛组(P<0.01)。结论:EMs疼痛与腹腔液IL-6及子宫在位内膜PGP9.5的含量有一定的关联性,两者可能是EMs患者的疼痛原因之一。