鬼臼苦素抗Ph^+急性淋巴细胞白血病细胞Sup-B15的作用及其机制

目的探讨鬼臼苦素(picropodophyllin,PPP)对Ph^+急性淋巴细胞白血病(Ph^+ALL)细胞Sup-B15的作用及其分子调控机制,为将PPP开发成为治疗Ph^+ALL药物提供理论依据。方法 MTS法检测PPP和格列卫(IM)对Sup-B15细胞增殖的影响;流式细胞术检测PPP和IM对Sup-B15细胞周期的影响;Western blot检测PPP对细胞增殖和周期相关蛋白表达,以及对IGF1R蛋白磷酸化和表达的影响。结果PPP和IM均呈时间和剂量依赖性关系抑制Sup-B15细胞的增殖,且相同剂量下PPP对细胞增殖的抑制作用均强于IM;PPP处理细胞12 h和24 h后G2/M期细胞比例显著升高,而S期细胞比例则相应减少;PPP能够上调p53和cyclin B1蛋白的表达以及抑制p21和c-myc蛋白的表达,但对IGF1R总蛋白表达水平和磷酸化水平均无明显影响。结论 PPP能有效抑制Sup-B15细胞增殖和诱导细胞发生G2/M期阻滞,其机制与上调p53和cyclin B1蛋白表达以及抑制p21和c-myc蛋白表达相关。

单倍体相合异基因造血干细胞移植治疗Ph^+急性淋巴细胞白血病的临床疗效

本研究旨在探讨亲缘间单倍体相合异基因造血干细胞移植(hi-HSCT)治疗Ph+急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)的可行性。对我院自2008年3月至2013年8月间接受亲缘hi-HSCT的22例Ph+ALL患者进行了临床疗效分析。22例患者移植前状态为:15例CR1,3例CR2,1例CR3,3例复发状态。获取亲缘单倍体供者骨髓+外周血干细胞移植。预处理药物采用阿糖胞苷(Ara-C)、白消安(Bu)、环磷酰胺(CTX)及全身照射等。联合使用环孢素A(Cs A)+短程甲氨蝶呤(MTX)+吗替麦考酚酯(MMF)+抗人胸腺细胞球蛋白(ATG)等预防移植物抗宿主病(GVHD)。结果显示:22例患者均获得造血重建,ANC≥0.5×109/L及Plt≥20×109/L的平均时间分别为13 d及23 d;患者随访时间中位数为13个月,随访期间10例发生不同程度的a GVHD,8例发生c GVHD;因感染死亡2例,GVHD死亡3例,复发死亡3例,其余14例患者仍无病存活,2年无病存活(DFS)率为57%。结论:亲缘间hi-HSCT是治疗Ph+ALL的有效方法,可使部分患者延长无病生存乃至治愈。

Ph^+/bcr-abl^+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测

为了探索检测Ph+ /bcr abl+ 急性淋巴细胞白血病 (ALL)患者的微小残留病变 (MRD)的简便而灵敏的方法 ,对 84例初治ALL患者和其中的缓解期患者的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT PCR检测。结果表明 ,缓解期患者骨髓中不存在Ph′染色体 ,巢式RT PCR方法检测到 11/ 14例缓解期患者存在MRD(bcr abl融合基因 ) (阳性率 78 5 7% ) ,而流式细胞术检测到 5 / 14的缓解期患者阳性 (阳性率 35 71% )。巢式PCR的灵敏度达到 10 -6- 10 -7水平 ,流式细胞检测的灵敏度达到 10 -4- 10 -5水平。结论 :Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏 ,而巢式RT PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高 ,且更易于开展应用。

bcr/abl反义RNA片段对Ph^+人白血病细胞系致瘤性和存活的影响(英文)

构建了表达2、3和4个相同241bp b3/a2型bcr/abl融合基因的反义RNA片段的重组质粒,酶切电泳和以241bp bcr/abl基因片段为探针进行的菌落原位杂交证实各目的片段已插入逆转录病毒表达载体,分别命名为pDAB2、pDAB3和pDAB4。用脂质体介导的方法将pDAB3导入Ph^+人白血病细胞系(K562和BV173细胞),48小时后用G418进行抗性筛选,观察了对靶细胞增殖的影响。结果表明,外源质粒在靶细胞内表达的反义RNA片段,使细胞致瘤性消失及诱发凋亡。探讨了可能的作用机理。

Wt1基因与Ph^＋白血病细胞系K562的生物学特性

Wt1基因是与造血调控、白血病发生及治疗预后密切相关的双功能基因,在急性髓系白血病及慢性粒细胞白血病进展期呈高表达,且与预后呈负相关,已用于临床微量残留病的监测。WT1蛋白不同亚细胞定位发挥不同生物学功能。本研究旨在探讨Ph+白血病细胞系K562中wt1 mRNA及蛋白的表达与定位,wt1抑制剂——姜黄素(curcumin)对K562细胞的增殖及细胞周期的影响及wt1在白血病发生发展中的相关作用机制。采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术分析细胞周期改变;免疫荧光技术及Western blot观察WT1蛋白的亚细胞定位及药物处理后表达水平的变化;实时定量PCR法观察药物处理后wt1及bcr/ablp210转录本水平的变化。结果表明,wt1 mRNA及蛋白在K562细胞高表达,姜黄素及格列卫均能降低wt1 mRNA及蛋白的表达水平,抑制细胞增殖;姜黄素使K562细胞停滞于G2/M期,而格列卫使其停滞于G0/G1期。结论:wt1基因表达改变可以影响Ph阳性细胞—K562的生长、增殖,调控wt1表达有可能成为Ph阳性白血病的新的治疗策略。

Ca2+-NFAT信号通路在骨髓基质细胞介导的费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病耐药中的作用

目的:探讨Ca2+-活化T细胞核因子(nuclear factors of activated T cells,NFAT)信号通路在骨髓基质细胞介导的费城染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)耐药中的作用。方法:聚合酶链式反应检测Sup-B15细胞及Ph+ALL原代细胞NFAT mRNA的转录水平;流式细胞术检测Sup-B15细胞P-糖蛋白表达;Western blot检测Sup-B15细胞NFAT蛋白的变化;Annexin V/7-AAD标记细胞,流式细胞术检测细胞凋亡;Fluo 3-AM染料标记细胞,流式细胞术检测共培养后白血病细胞Ca2+浓度变化。结果:Sup-B15细胞及Ph+ALL原代细胞中均可检测到NFAT表达;流式细胞术未检测到Sup-B15细胞表达P-糖蛋白;临床应用的治疗浓度(2.5和5μmol/L)的环孢素(CAS)可明显抑制NFAT蛋白表达,其中5μmol/L CAS抑制作用更明显;临床治疗浓度CAS(2.5和5μmol/L)对Sup-B15细胞的凋亡无明显影响,而较高浓度CAS(10μmol/L)可诱导Sup-B15细胞的凋亡。骨髓基质细胞OP9可使Sup-B15细胞及Ph+ALL原代细胞对伊马替尼的敏感性下降;与骨髓基质细胞OP9共培养后Sup-B15细胞Ca2+浓度升高,总NFAT蛋白水平及核蛋白水平均增加;在共培养体系中加入环孢素抑制Ca2+-NFAT信号通路,可降低OP9对Sup-B15细胞的保护作用。结论:Ca2+-NFAT信号通路有助于Ph+ALL细胞的存活,骨髓基质细胞+可通过活化Ca2+-NFAT信号通路介导Ph+ALL细胞对IM的耐药。

c-myc抑制剂10058-F4对Ph^+ALL细胞凋亡的影响及相关机制研究

目的探讨c-myc抑制剂10058-F4对Ph^+急性淋巴细胞白血病(Ph^+ALL)细胞Sup-B15的作用及其分子调控机制,为将10058-F4开发成为治疗Ph^+ALL药物提供理论依据。方法流式细胞术检测10058-F4对Sup-B15细胞凋亡和细胞周期的影响,以及对Ph^+和Ph^-的原代ALL细胞凋亡和坏死的影响;Western blotting检测10058-F4对c-myc及其下游调控基因蛋白表达的影响。结果 10058-F4显著地诱导Sup-B15细胞凋亡,但对细胞周期无明显影响;10058-F4分别诱导Ph^+和Ph^-的原代ALL细胞发生明显的凋亡和坏死。40μmol/L的10058-F4显著抑制c-myc、Bcl-xl、Mcl-1和Bcl-abl的蛋白表达,但对Bcl-2、Bax和p-crkl蛋白表达均无明显影响。阳性对照药物PPP和IM均显著抑制c-myc、Mcl-1和p-crkl蛋白的表达,同时,PPP也明显地抑制Bcl-2蛋白的表达。结论 10058-F4能有效促进Ph^+的Sup-B15细胞系和原代细胞的凋亡,其机制与抑制c-myc及其调控的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达相关。

Glut5在Ph^+急性淋巴细胞白血病伊马替尼耐药中的机制研究

目的采用费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph^+ALL)伊马替尼耐药细胞株SUP-B15/R研究伊马替尼耐药的可能机制。方法通过基因芯片分析法对比找出伊马替尼耐药株SUP-B15/R与敏感株SUPB15/S之间表达差异的基因,筛选出可能与耐药相关的基因SLC2A5,分别采用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot进一步验证SLC2A5及其编码蛋白葡萄糖转运体5(Glut5)在SUP-B15/R与SUP-B15/S之间表达的差异。采用MTT实验检测果糖对SUP-B15/S细胞伊马替尼敏感性的影响,以及qPCR检测相关信号通路的改变,探究Glut5表达增加在SUP-B15细胞伊马替尼耐药中的作用。结果基因芯片结果发现,与细胞代谢相关的SLC2A5基因在SUP-B15/R中高表达,qPCR和Western blot实验进一步验证了上述结果。而果糖处理后SUPB15/S细胞对伊马替尼的敏感性下降,IC50由(44.50±2.38)μmol/L增加到(64.71±1.69)μmol/L,同时Glut5、PI3 K、AKT mRNA表达增强。结论 SUP-B15/R细胞高表达SLC2A5,Glut5高表达促进细胞对果糖的吸收,激活伊马替尼作用下受到抑制的PI3K/AKT信号通路,导致SUP-B15细胞对伊马替尼耐药。

IGF1-R抑制剂AEW541对伊马替尼杀伤SUP-B15细胞的增效作用

目的:探讨伊马替尼处理Ph^(+)ALL细胞株SUP-B15时是否出现细胞增殖受抑但不凋亡的耐受状态,探索IGF1-R抑制剂AEW541能否打破这种耐受状态以及相关机制。方法:使用不同浓度伊马替尼或AEW541处理SUP-B15细胞,Deep Blue试剂测定细胞增殖,Annexin V/7-AAD测定细胞凋亡;AEW541和伊马替尼联合处理SUP-B15细胞后流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot测定凋亡相关标志caspase-3和PARP1切割以及ABL下游信号STAT5、ERK1/2和AKT的磷酸化;STAT5和MEK-ERK1/2抑制剂进一步确认伊马替尼联合AEW541诱导SUP-B15细胞凋亡的关键机制。结果:伊马替尼单药处理能有效抑制SUP-B15细胞增殖,但没有显著增加SUP-B15细胞的凋亡率从而出现耐受状态;AEW541单药对SUP-B15细胞增殖与凋亡没有显著影响,但与伊马替尼合用时能显著增加SUP-B15细胞凋亡率及caspase-3和PARP1的切割;AEW541与伊马替尼联合处理SUP-B15较伊马替尼单药STAT5和ERK1/2磷酸化水平更低而对AKT磷酸化水平无明显影响;STAT5抑制剂AC-4-130而非MEK-ERK1/2抑制剂曲美替尼能诱导SUP-B15细胞凋亡。结论:SUP-B15细胞株可对伊马替尼呈现药物耐受,IGF1-R抑制剂AEW541可进一步降低STAT5的活化,继而增强伊马替尼对SUP-B15细胞的凋亡诱导作用,这为打破耐受提供新思路。

c-cbl反义RNA抑制K562细胞的增殖

为探讨原癌基因c-cbl对CML细胞增殖的影响,我们用RT-PCR克隆了包括5′端非编码区的人类c-cbl基因部分序列,将之反向插入pcDNA3载体,并转染K562及NB4细胞。经MTT实验、半固体集落培养和流式细胞术观察细胞增殖能力的改变。结果表明,限制性酶切分析及序列测定证明所克隆的基因核苷酸序列正确,MTT实验显示反义载体转染K562细胞生长明显受抑,24、48及72小时增殖抑制率分别为30.07％,42.53％和55.75％(P值均<0.001),FCM-BrdU法测定的细胞倍增时间之比为1∶1.87(P<0.02),细胞集落形成抑制率为33.01％,反义转染基因NB4细胞增殖率无改变。上述结果直接地证明了c-cbl在CML细胞生长中的重要性。