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基于PHA颗粒-PhaP标签和内含肽元件的极端嗜盐古菌蛋白的表达纯化系统
1
作者
伍锦花
蔡双凤
+4 位作者
刘海龙
侯靖
韩静
周坚
向华
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第9期998-1009,共12页
【目的】建立一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便实用的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并探讨嗜盐古菌内含肽在该系统优化中的应用。【方法】以嗜盐古菌-大肠杆菌穿梭载体pWL502为基本骨架,构建带有嗜盐古菌强启动子和PhaP融合标签的表达载...
【目的】建立一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便实用的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并探讨嗜盐古菌内含肽在该系统优化中的应用。【方法】以嗜盐古菌-大肠杆菌穿梭载体pWL502为基本骨架,构建带有嗜盐古菌强启动子和PhaP融合标签的表达载体;在地中海富盐菌phaP缺陷株(ΔphaP)中融合表达目的基因,通过蔗糖密度梯度离心分离纯化结合于PHA颗粒上的PhaP融合蛋白;在phaP基因与多克隆位点之间引入特定的嗜盐古菌内含肽元件,尝试通过定点突变改变该内含肽的剪切活性。【结果】成功构建了以PhaP作为N端融合标签的表达载体pPM以及作为C端融合标签的载体pIP;在phaP基因簇强启动子控制下,二者均实现了目标蛋白的高效表达;通过PHA颗粒介导的蛋白分离纯化策略,实现了以PhaP为融合标签的目标蛋白的分离纯化;发现内含肽序列Hbt21在地中海富盐菌中保持了高效的剪接活性,通过定点突变其C端末位氨基酸天冬酰胺(N182)及邻位的丝氨酸(S183)失活了该内含肽的C端剪接活性。【结论】首次建立了一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便节约的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并确定了嗜盐古菌型内含肽C端剪接的活性位点,为该内含肽将来应用于PhaP融合蛋白的标签去除奠定了基础。
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关键词
极端嗜盐古菌
表达载体
聚羟基脂肪酸酯颗粒
phap标签
内含肽
原文传递
题名
基于PHA颗粒-PhaP标签和内含肽元件的极端嗜盐古菌蛋白的表达纯化系统
1
作者
伍锦花
蔡双凤
刘海龙
侯靖
韩静
周坚
向华
机构
中国科学院微生物研究所
中国科学院大学
出处
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第9期998-1009,共12页
基金
国家自然科学基金重点项目(31330001)~~
文摘
【目的】建立一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便实用的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并探讨嗜盐古菌内含肽在该系统优化中的应用。【方法】以嗜盐古菌-大肠杆菌穿梭载体pWL502为基本骨架,构建带有嗜盐古菌强启动子和PhaP融合标签的表达载体;在地中海富盐菌phaP缺陷株(ΔphaP)中融合表达目的基因,通过蔗糖密度梯度离心分离纯化结合于PHA颗粒上的PhaP融合蛋白;在phaP基因与多克隆位点之间引入特定的嗜盐古菌内含肽元件,尝试通过定点突变改变该内含肽的剪切活性。【结果】成功构建了以PhaP作为N端融合标签的表达载体pPM以及作为C端融合标签的载体pIP;在phaP基因簇强启动子控制下,二者均实现了目标蛋白的高效表达;通过PHA颗粒介导的蛋白分离纯化策略,实现了以PhaP为融合标签的目标蛋白的分离纯化;发现内含肽序列Hbt21在地中海富盐菌中保持了高效的剪接活性,通过定点突变其C端末位氨基酸天冬酰胺(N182)及邻位的丝氨酸(S183)失活了该内含肽的C端剪接活性。【结论】首次建立了一个基于PHA颗粒-PhaP标签的简便节约的极端嗜盐古菌蛋白表达纯化系统,并确定了嗜盐古菌型内含肽C端剪接的活性位点,为该内含肽将来应用于PhaP融合蛋白的标签去除奠定了基础。
关键词
极端嗜盐古菌
表达载体
聚羟基脂肪酸酯颗粒
phap标签
内含肽
Keywords
extremely halophilic archaea, expression vector, polyhydroxyalkanoate granules,
phap
-tag, intein
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
基于PHA颗粒-PhaP标签和内含肽元件的极端嗜盐古菌蛋白的表达纯化系统
伍锦花
蔡双凤
刘海龙
侯靖
韩静
周坚
向华
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014
0
原文传递
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