蝴蝶兰组织培养中的褐化控制研究

系统研究了吸附剂(活性炭、PVP)与柠檬酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素C和硫代硫酸钠5种抗氧化剂对蝴蝶兰组培中褐化的影响。结果表明:活性炭能有效控制褐化和促进生长,但不利于分化;谷胱甘肽控制褐化的效果虽不及活性炭,但综合效果最佳。

蝴蝶兰组培不定芽增殖条件的优化

以黄花蝴蝶兰的花梗腋芽诱导出的不定芽为外植体,利用正交设计法研究了培养基的无机营养、TDZ、有机添加物和蔗糖4种因素对不定芽增殖的影响。结果表明:蝴蝶兰不定芽增殖的最佳培养基配方为KC+TDZ 0.20 mg/L+椰子水200 mL/L+蔗糖14 g/L+柠檬酸30 mg/L,其中有机添加物的种类和浓度对不定芽增殖的影响最大。

蝴蝶兰的组织培养和快速繁殖

通过诱导残败花梗上的休眠芽萌发,以萌发的幼叶和去茎尖的茎段为外植体进行组织培养,建立了蝴蝶兰(PhalaenopsisamabilisBl.)的无菌繁殖体系,并筛选出最佳培养基组成。诱导休眠芽萌发的最佳培养基为不加任何激素的MS0培养基;原球茎诱导的适宜培养基为MS+3.0mg·L-16 BA+0.5mg·L-1ZT+30mg·L-1柠檬酸和MS+5.0mg·L-16 BA+30mg·L-1柠檬酸+30%椰乳(CM),其中茎段的诱导效果明显优于叶片,诱导率达95%;诱导无菌苗生根的最适培养基为1/4MS+1.0mg·L-16 BA+0.1mg·L-1NAA,生根率可达79%。

蝴蝶兰叶片对低温胁迫的生理响应

以3个蝴蝶兰品种(系)(耐冷品种婚宴,不耐冷品种聚宝,中等耐冷性新品系ZD-1)为试验材料,经预处理后,测定各材料在低温(10℃、5℃和0℃)下处理12、24和48 h后叶片相对电导率、叶片中可溶性糖和丙二醛(MDA)含量以及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)与抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性.结果表明:随着胁迫程度的加深,蝴蝶兰叶片的相对电导率和MDA含量逐渐增加,可作为蝴蝶兰耐冷性的鉴定指标;可溶性糖含量的变化无明显规律;CAT和SOD酶活性随着胁迫程度的加深先增大后减小;APX活性则呈持续增加趋势,也可作为蝴蝶兰耐冷性的鉴定指标;耐冷性品种婚宴在一定程度低温胁迫条件下能通过自身酶系统的保护,减少活性氧对其的伤害,而不耐冷品种聚宝的自身酶系统的保护能力较差.

蝴蝶兰红花系品种间杂交结果率研究

选取9个蝴蝶兰红花系品种按完全双列杂交进行自交与杂交，共获得5个自交组合与16个杂交组合．总结果率为9．3％，其中自交结果率为22．2％，杂交结果率为7．7％．各组合果荚生长曲线走势大致相同，授粉后7～9d，子房开始膨大，约于50d趋于平稳状态．平均果实采收时间、质量、长及宽分别为（103±4）d，（3．41±0．18）g、（5．50±0．43）cm及（9．37±0．54）mm．果质量、果长、果宽三者之间呈正线性相关．

蝴蝶兰几丁质酶基因的克隆及表达特性分析

利用RT-PCR及RACE技术,克隆到蝴蝶兰1个几丁质酶基因PhCHT(GenBank登录号为KT992851),该基因cDNA全长1 210bp,包含37bp的5′-UTR、933bp开放阅读框和240bp 3′-UTR,编码310个氨基酸;该蛋白为糖苷水解酶第19家族成员,兼具有溶菌酶活性;生物信息学分析显示,该蛋白具N-端信号肽和跨膜结构,为胞外分泌蛋白;该蛋白与海枣、谷子、油棕和拟南芥的几丁质酶类似蛋白相近,并且在系统进化树上与甘蔗和陆地棉的Ⅶ类几丁质酶同属一个分支。PhCHT基因的表达分析表明,PhCHT在蝴蝶兰营养器官和生殖器官中均有表达,根中表达量最高;13℃/8℃低温处理3、6、9和15d时该基因的表达被抑制,4℃低温处理1、2和4h表达量升高。研究表明,PhCHT基因能够响应短期的冷胁迫。研究结果为进一步研究蝴蝶兰几丁质酶的系统进化及抗性育种奠定了基础。

蝴蝶兰组织培养及诱变育种的研究进展

从蝴蝶兰(phalaenopsis)的组织培养及诱变育种两个方面进行了探讨。就当前蝴蝶兰外植体的选择、培养基的选择、原球茎增殖、生根壮苗、炼苗移栽化学诱变几个方面作了详细的讨论。

外源NO缓解蝴蝶兰低温胁迫伤害的生理机制研究

以蝴蝶兰品种‘台湾黄金’幼苗(苗龄15个月)为试验材料,通过叶面喷施200μmol·L-1的NO供体硝普钠(SNP),低温胁迫(昼/夜:12℃/7℃)处理5d和10d,分别测定叶片电解质渗漏率、丙二醛(MDA)含量、pH、渗透调节物质含量及几种保护酶活性,探讨外源NO缓解蝴蝶兰低温胁迫伤害的生理机制。结果表明:低温胁迫条件下,预施SNP处理可以有效抑制蝴蝶兰叶片电解质渗漏率、MDA含量和pH的上升,显著提高叶片可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸(Pro)含量,显著延缓超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶活性的下降,增强多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。研究认为,外源NO供体SNP可以通过保护蝴蝶兰幼苗的细胞膜系统,增加渗透调节物质含量,提高保护酶活性来减轻低温胁迫对蝴蝶兰幼苗的伤害,提高其抗低温胁迫的能力。

蝴蝶兰组培苗瓶外生根的研究

为降低蝴蝶兰组培苗生产成本、缩短种苗繁育周期,利用瓶外生根技术,研究不同蝴蝶兰品种、组培苗的不同培养阶段、不同激素种类和浓度对组培苗瓶外生根的影响。结果表明,不同蝴蝶兰品种的组培苗瓶外生根有所差异,3个蝴蝶兰品种瓶外生根效果由好到次的排序是:"柳林黑玫瑰">"文景天使">"大辣椒";经过壮苗培养的组培苗适宜进行瓶外生根;用100 mg/L的IBA溶液处理,瓶外生根效果最好,生根率为94.80%,平均根数为3.72条,平均叶数4.24片,生根时间为38.00 d;用100 mg/L的NAA溶液处理,瓶外生根效果较好,生根率为86.80%,平均根数为3.84条,平均叶数3.30片,生根时间为36.40 d。

蝴蝶兰热激蛋白基因PhHsp70序列分析及对冷胁迫的响应

通过RT-PCR和RACE相结合的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个热激蛋白基因PhHsp70 c DNA序列(Gen Bank登录号为MG214259),该基因全长为2 239 bp,编码647个氨基酸,与多种植物的HSP70基因具有94%以上的相似性;其编码蛋白包含HSP70结构域,属于胞质型HSP70;系统进化分析显示,该蛋白与铁皮石斛的HSP70蛋白亲缘关系最近;PhHsp70基因在营养器官和生殖器官中均有表达,其中在根中表达水平最高,在花器官中表达水平较低;PhHsp70基因在4℃冷胁迫处理0.5 h表达水平下降,冷胁迫1 h后,表达水平升高,在处理24 h时表达水平最高。由此推测,PhHsp70基因参与蝴蝶兰4℃冷胁迫的生理反应。研究结果可为研究蝴蝶兰热激蛋白在低温胁迫响应中的调控机理提供理论基础。

利用从芽途径快速繁殖蝴蝶兰的研究

报道了利用从生芽途径快速繁殖蝴蝶兰的研究结果,试验表明:培养基MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.05mg·L-1+GA30.5mg·L-1能够诱导花梗休眠芽转化为营养芽.花梗芽在培养基MS+BA5.0mg·L-1+NAA0.05mg·L-1上能够诱导产生丛生芽.在丛生芽增殖阶段,以BA12.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1的增殖效果最好.BA、KT、ZT均能诱导产生"丛生芽",其中以ZT和BA的诱导效果最好.另外,在增殖阶段,外植体采用双芽接较单芽接的增殖效果好.在生根阶段以1 2MS+NAA0.5mg·L-1+w=0.2%的活性炭+φ=10%的椰子水的生根效果较佳,生根率可达100%,且植株生长健壮.试管苗移栽在水苔上的成活率较高,成活率达96 7%.

蝴蝶兰基因工程研究进展

蝴蝶兰作为热带和亚热带最重要的观赏花卉之一,在基因工程的改良上有着诱人的前景。综述了蝴蝶兰遗传转化的转基因受体材料、导入的外源基因和克隆的相关基因、抗病毒基因的研究现状,展望了蝴蝶兰转基因技术及其应用前景。

蝴蝶兰亲环素基因PhCyP的克隆及表达分析

为研究蝴蝶兰对低温胁迫分子调控的机理,采用RT-PCR和RACE方法,从蝴蝶兰叶片中克隆到一个亲环素基因PhCyP(登录号为MH992514),其基因cDNA全长序列为829 bp,开放阅读框长度为522 bp,编码173个氨基酸,其编码蛋白含有一个类亲环素(CLD)保守结构域,为碱性亲水性蛋白。系统进化分析显示,蝴蝶兰PhCyP蛋白与兰科植物小兰屿蝴蝶兰、万带兰、深圳拟兰、铁皮石斛等亲环素蛋白亲缘关系较近。转录表达分析表明,PhCyP基因在蝴蝶兰不同发育时期的根、叶、花梗、花器官、子房、种子等组织中有高丰度表达。在13℃/8℃(昼/夜)温度条件下,PhCyP基因的表达水平先降低,处理6 d时降至最低,随后逐渐升高至恢复培养。在4℃低温条件下,PhCyP基因的表达水平升高,在处理4 h升至最高,然后逐渐下降,在处理48 h其表达低于处理前水平。以上结果表明,PhCyP基因参与蝴蝶兰对低温胁迫的响应,且对不同低温胁迫具有不同的分子调控机制。

蝴蝶兰原球茎和丛生芽增殖条件优化

分别以蝴蝶兰(Phalaenop spp)原球茎(Protocorm like body,PLB)和幼芽为外植体,研究了蝴蝶兰原球茎和丛生芽增殖的适宜条件。结果表明,适合于原球茎增殖的培养基为1/3MS+TDZ 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂8 g/L+活性炭2 g/L+CM 200 mL/L。适合于丛生芽增殖的培养基为1/3MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂8 g/L+活性炭2 g/L+CM 200 mL/L。TDZ的效果好于6-BA。对丛生芽的切割能显著提高增殖倍数。

蝴蝶兰C类花器官发育基因PhAG1a的克隆及表达分析

为研究MADS-box基因在花器官发育中的功能,进一步理解兰科植物花器官发育的分子调控机理。利用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰中克隆了一个MADS-box基因PhAG1a(GenBank登录号为KY399811),并利用实时荧光定量方法分析其表达特性。序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 107 bp,含完整的开放阅读框,可编码248个氨基酸,属于C功能AGAMOUSE家族基因,与蝴蝶兰属的PhalAG1和PeMADS1基因关系最近;表达模式分析表明,PhAG1a基因在营养器官中不表达,只在蕊柱和子房中表达。在5类突变体花器官中,PhAG1a基因在退化雄蕊变异为侧瓣、侧瓣退化与蕊柱合生和侧萼片变异为唇瓣等3类突变体花器官中,PhAG1a基因的表达没有变化,在侧瓣变异为唇瓣和侧瓣顶端长出花药的突变体花器官中,PhAG1a基因在蕊柱中的表达水平显著降低。推测该基因在决定蝴蝶兰合蕊柱的发育中起重要的调控作用。

蝴蝶兰和嘉德利亚兰的离体快速繁殖

以蝴蝶兰和嘉德利亚兰茎尖腋芽为外植体接种于ＭＳ、Ｗｈｉｔｅ、Ｋ、Ｔ４及添加不同激素配比的改良ＭＳ培养基上，观察其原球茎增殖和幼苗分化生长效果，结果表明，蝴蝶兰和嘉德利亚兰在添加６－ＢＡ５ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ的改良ＭＳ培养基上原球茎增殖效果最好，分别有５０％和８０％以上的原球茎表现增殖，原球茎易分化长苗，每个原球茎可分别分化生长１～２个和５～８个幼芽。其它培养基对此两种兰花的原球茎增殖和幼苗分化生长均无明显的促进作用。

影响蝴蝶兰花梗芽增殖率因素的研究

[目的]研究影响蝴蝶兰花梗芽增殖率的因素。[方法]在蝴蝶兰花芽产生期分别采集2、3、4、5和6cm的花梗芽为试材，并把材料设成1／4、1／2、3／4的节段，研究花梗芽采摘时间、培养基配方和暗培养对蝴蝶兰花梗芽增殖率的影响。[结果]5—6cm的花梗芽和3～4cm的花梗芽在分化腋芽数量上有所差异，但在总增殖率上没有明显差异。暗培养能更好诱导不定芽的产生，但对1／4和1／2节段的花梗芽影响较大。从节位来看，3／4的花梗芽诱导效果最好。筛选培养基的正交试验发现，KCl及KT能有效提高增殖率，N从对花梗芽增殖有抑制作用。[结论]试验筛选的培养基1／2MS＋KCl 1．0g／L＋BA5．0mg／L＋NAA0．6mg／L＋KT 1．0mg／L可使蝴蝶兰花梗芽的增殖率达到8．5个．是试验初始增殖率的3～4倍。

蝴蝶兰类原球茎DNA总甲基化水平测定方法的研究

探讨DNA提取中不同蛋白质变性剂对胞嘧啶(C)和5-甲基胞嘧啶(5mC)色谱的影响,建立蝴蝶兰类原球茎DNA总甲基化水平的HPLC测定方法。本实验采用2种CTAB法(蛋白质变性剂不含酚和含酚)提取基因组DNA,水解后分别以反相HPLC测定C和5mC含量。色谱条件为:色谱柱HypersilBDS Cl8,甲醇-10mmol/L戊烷磺酸钠-三乙胺(6∶90∶0.2,V/V)为流动相,流速0.5ml/min,检测波长273nm。应用不含酚变性剂所提取DNA的水解液C和5mC能较有效分离。以本试验优化的DNA提取方法和HPLC色谱条件,基因组DNA水解液的C和5mC色谱可得到较好的效果。

蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导的氧化还原动态

离体培养蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)类原球茎切块诱导胚性愈伤组织,在培养第11～18 d时出现胚性细胞,第25～32 d观察到幼嫩的球形胚。在培养第0～11 d,外植体.OH相对含量波动不大,O2.生成速率持续提高并达到高峰,H2O2水平明显提高,抗氧化能力在低位波动,推测外植体可能经受较强的氧化胁迫,以利细胞脱分化和获得胚性潜能。此外,此期间SOD活性持续提高,POD和CAT活性达到一个高峰。在愈伤组织诱导全过程中,总抗氧化能力、DPPH自由基清除率、H2O2水平基本上都持续提高,与SOD活性均极显著正相关,SOD是影响培养物清除自由基能力和提高抗氧化水平的主要因素。综合分析实验结果表明,在蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导过程中,SOD、O2.和H2O2起到关键的作用。

抗氧化剂减缓长期继代蝴蝶兰类原球茎衰老及生理指标变化

为减缓长期继代蝴蝶兰类原球茎增殖、萌发能力降低,在培养基中添加抗氧化剂继代类原球茎24个月,观测类原球茎增殖能力、成活率及萌发率,并分析其生理学指标。结果表明:100 mg/L半胱氨酸与8.0 g/L甘露醇组合为适宜抗氧化剂浓度;在培养第24个月,处理组每瓶鲜重较对照组显著提高,萌发率极显著提高;培养期间对照组和处理组类原球茎的总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性均有不同程度的下降,处理组总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性较对照极显著提高(主要在第16个月),对照组与处理组叶绿素水平均变化不明显。