基于血清药物化学和网络药理学的知母-黄柏药对盐炙前后治疗2型糖尿病药效物质基础及作用机制分析

目的基于液质联用技术对生知母-生黄柏、盐知母-盐黄柏药对水提液灌胃给药后大鼠入血成分分析,结合网络药理学预测盐炙在知母-黄柏药对治疗2型糖尿病的影响,并通过体外实验进行初步验证。方法大鼠连续灌胃给药生知母-生黄柏药对、盐知母-盐黄柏药对水提液2次,中间间隔1 h,末次给药60 min后腹主动脉取血,用甲醇沉淀蛋白法处理后复溶,采用色谱柱Shim-pack GIST C 18(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相A相为0.1%甲酸水,B相为0.1%甲酸-乙腈;梯度洗脱,正、负离子全扫描模式,质量扫描范围m/z 100~1500。结合数据库二级谱图及文献,分析鉴定生知母-生黄柏、盐知母-盐黄柏药对的入血成分。检索2型糖尿病疾病靶点,对入血成分和疾病的交集靶点进行蛋白质互作网络分析、GO、KEGG通路富集分析,构建“入血成分-靶点”网络图,运用AutoDock软件对筛选出的核心成分和核心靶点进行分子对接验证。验证实验以HepG2细胞为实验对象,胰岛素联合高糖诱导胰岛素抵抗模型,CCK8法检验盐炙前后知母-黄柏药对对细胞增殖影响,Western blot检测PI3K-AKT信号通路相关蛋白的表达情况。结果生知母-生黄柏药对水提液大鼠血清中鉴定出15种原型成分,1个芒果苷代谢成分。盐知母-盐黄柏药对水提液大鼠血清中鉴定出17个原型成分,1个芒果苷代谢成分。盐炙后入血成分中芒果苷、小檗碱、3-异丁基戊二酸等成分含量较生品高。KEGG和GO结果显示,知母-黄柏药对治疗2型糖尿病可能与RNA聚合酶的转录调控、炎症反应、AGE-RAGE、PI3K-AKT、胰岛素抵抗等通路有关。细胞实验表明盐炙前后知母-黄柏药对可以上调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4蛋白表达,且盐炙组效果优于生品组。结论初步阐释了知母-黄柏药对盐炙前后入血成分,阿魏酸、小檗碱、小檗红碱、芒果苷与mTOR、SIRT1、EGFR、PPARA等可能是知母-黄柏药对盐炙后增强2型糖尿病治疗效果的主要成分和靶点,其机制可能是增强了PI3K-AKT等相关通路的作用,为知母-黄柏药对盐炙前后药效物质基础研究及临床应用提供重要参考。

知母-黄柏药对改善D-半乳糖诱导衰老小鼠认知障碍的机制研究

目的:研究知母-黄柏药对(简称“知柏”)对D-半乳糖(D-gal)诱导衰老模型小鼠认知障碍的改善作用,并探讨其作用机制。方法:将75只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组(D-gal 125 mg/kg)、吡拉西坦组(468 mg/kg)、知柏组(4.5 g/kg)和雷帕霉素哺乳靶蛋白(mTOR)抑制剂组(依维莫司,RAD001,3mg/kg),每组15只。通过D-gal建立小鼠衰老模型,并连续8周灌胃给予知柏水煎液。采用Morris水迷宫和新物体识别测试评价衰老模型小鼠的认知功能;HE染色法观察各组小鼠海马组织病理变化情况;尼氏染色和高尔基染色观察海马区神经元和突触的病理形态变化;收集海马组织以测定脑内三磷酸腺苷(ATP)含量,Western Blot法检测海马中泛素结合蛋白62(P62)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin-1)、突触素(Syn)、突触后密度蛋白-95(PSD-95)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、mTOR的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测海马中Syn、AMPK、mTOR基因表达水平。结果:与空白组相比,模型组小鼠在Morris水迷宫和新物体识别测试中表现出认知功能显著降低(P<0.01)。在模型组中,海马区的细胞数量减少,细胞排列松散,神经元形态不规则,尼氏小体数量明显减少,树突分支数量以及树突棘密度也显著减少。模型组小鼠海马中ATP水平、P62、Syn、PSD-95、mTOR蛋白表达显著降低(P<0.01),Beclin-1表达显著升高(P<0.01),pAMPK/AMPK蛋白含量比值和AMPK基因表达显著升高(P<0.01),Syn和mTOR基因表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,吡拉西坦组和知柏组小鼠的认知功能得到了显著改善,表现为Morris水迷宫测试中潜伏期的显著缩短(P<0.01),穿越平台次数和靶象限停留时间显著增加(P<0.01),以及新物体识别指数的显著升高(P<0.01),海马区树突棘密度显著增加(P<0.01),神经元损伤也在一定程度上得到了缓解。海马中ATP水平、P62、Syn、PSD-95和mTOR蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05),Beclin-1蛋白表达显著降低(P<0.01),pAMPK/AMPK蛋白含量比值和AMPK基因表达显著降低(P<0.01,P<0.05),Syn、mTOR基因表达显著升高(P<0.01)。抑制剂RAD001组与模型组结果相似,经知柏治疗后上述指标均有所回调。结论:知柏可能通过激活AMPK/mTOR信号通路抑制神经元过度自噬,增强突触可塑性,改善由D-gal引起的小鼠认知障碍。

滋肾通关方中肉桂反佐配伍对黄柏-知母药对在大鼠体内活性成分组织分布的影响

目的探讨滋肾通关方中肉桂反佐配伍对黄柏-知母药对的活性成分在正常大鼠体内组织分布的影响及其作用机制。方法将56只Wistar大鼠随机分为空白组(等量生理盐水),滋肾通关方低、中、高剂量组(5,10,20 g/kg),黄柏-知母药对低、中、高剂量组(5,10,20 g/kg),各8只。分别灌胃相应药物1 h后取大鼠心、肝、脾、肺、肾组织并制备匀浆液,采用超高效液相色谱串联质谱法测定大鼠体内组织匀浆液中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量。结果与黄柏-知母药对低、中、高剂量组比较,滋肾通关方低、中、高剂量组大鼠心、肝、脾、肺、肾组织匀浆液中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量整体更高;滋肾通关方高剂量组大鼠肺组织匀浆液中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量显著高于黄柏-知母药对高剂量组(P<0.05),滋肾通关方低剂量组大鼠心组织中黄柏碱的含量显著高于黄柏-知母药对低剂量组(P<0.05)。结论滋肾通关方中肉桂反佐配伍黄柏-知母药对的作用机制可能与改变药对中活性成分在组织中的分布有关。

知母-黄柏药对盐炙前后HPLC指纹图谱及多指标成分含量变化

目的建立知母-黄柏药对盐炙前后HPLC指纹图谱,对11种指标性成分进行定量分析,探索药对盐炙前后的质量差异。方法采用HPLC法建立知母-黄柏药对盐炙前后指纹图谱,通过化学计量学方法对知母-黄柏药对盐炙前后指纹图谱进行分析;并采用HPLC法测定知母-黄柏盐炙前后药对中新芒果苷、绿原酸、隐绿原酸、黄柏碱、芒果苷、木兰花碱、药根碱、小檗红碱、小檗碱、柠檬苦素、黄柏酮的含量。结果10批知母-黄柏药对盐炙前后HPLC指纹图谱组内相似度均>0.988,聚类分析、偏最小二乘法-判别分析可明显将生知母-生黄柏、盐知母-盐黄柏分为2类,小檗碱、新芒果苷、芒果苷、小檗红碱、黄柏碱等成分可能是引起两者质量差异的主要标志成分。定量分析显示,知母-黄柏药对盐炙后芒果苷、黄柏碱、药根碱、小檗红碱、小檗碱的含量增加,而新芒果苷、绿原酸、隐绿原酸的含量降低,柠檬苦素的含量亦有降低趋势,木兰花碱、黄柏酮的含量无明显变化。结论所建立的指纹图谱及多指标含量测定方法稳定可靠,从定性与定量评价了知母-黄柏药对盐炙前后的质量差异;为知母-黄柏药对药味炮制研究提供一定的依据。

知母-黄柏药对抗炎药效部位筛选及作用机制研究

目的:筛选知母-黄柏药对的抗炎药效部位,并初步对其抗炎机制进行探讨。方法:制备知母-黄柏药对水煎液,通过D101树脂进行分离,分别用水、30%、60%、95%乙醇-水进行洗脱,制备不同极性部位。采用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型,用不同浓度的药对或各极性部位预处理细胞,MTT法检测细胞凋亡,Griess法检测NO分泌,筛选抗炎活性部位。ELISA法检测炎症因子分泌,Western blot检测炎症相关蛋白COX-2、iNOS蛋白水平及细胞核、细胞质中NF-κB p65含量。结果:知母-黄柏药对及30%醇洗部位能降低LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO,其中30%醇洗部位作用更为明显,其他部位无显著作用。30%醇洗部位能显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α分泌及iNOS、COX-2蛋白表达,并促进p65由细胞质进入细胞核。结论:知母-黄柏药对抗炎药效部位为30%醇洗部位,该药效部位可能通过抑制NF-κB信号通路,抑制iNOS、COX-2表达及相关炎症因子的分泌,保护LPS诱导的RAW264.7细胞损伤。

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的知母-黄柏药对入血成分分析

目的以正常家兔为实验对象,探讨知母-黄柏药对口服吸收后的入血成分。方法采用相当于生药量4.5 g·kg^(-1)的知母-黄柏水煎液灌胃家兔,每日1次,连续7 d,末次给药后取家兔含药血清,利用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术(UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS),在正、负两种离子模式下,根据保留时间、精确相对分子质量、二级质谱裂解碎片,确定入血成分。结果家兔含药血清中共鉴别出54个入血成分,包括46个原型入血成分,包括生物碱类、黄酮类、皂苷类、糖苷类、酚酸类、苯丙素类、内酯类、酚类衍生物;9个代谢产物,分别来源于小檗碱、药根碱、小檗红碱、芒果苷。结论知母-黄柏药对中含有46个可以入血的化学成分,还可能含有4个化学成分在体内代谢为9个代谢产物。

知母黄柏药对治疗糖尿病骨质疏松症的药效物质和作用机制研究进展

糖尿病骨质疏松症是由长期高血糖造成的全身代谢性骨病,已成为糖尿病的主要并发症之一,具有骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加等特点。知母黄柏药对是一个经典中药配伍组合,在多数抗糖尿病骨质疏松症方剂中都有体现。现代药理研究表明,药对促进骨形成和抑制骨吸收的药效作用与Nrf2、MAPK、Wnt、RANK/RANKL信号通路及细胞自噬等密切相关。药对配伍能改变药效物质的溶出度和药动学,且药效物质有协同增效的作用。本文总结了知母黄柏药对的药效物质和抗糖尿病骨质疏松症作用机制,为该药对的进一步研究和开发提供参考。

基于本草著作与《伤寒杂病论》解析黄芩、黄连、黄柏功用

黄芩、黄连、黄柏又称“三黄”,“三黄”的三焦分类法不能全面解释其在经典名方中的应用。对历代本草著作进行整理,根据古籍将“三黄”的主治功用以宋金两朝为界分类讨论。宋以前本草,以《神农本草经》为核心按“三黄”主治疾病进行论述;金以后本草,以新医理阐释《神农本草经》中“三黄”主治。横向对比发现,“三黄”虽都能治疗热证、消化系统疾病及皮肤黏膜病,但侧重不同:黄芩善调火热证之气机不畅、气机逆乱,黄连能疗实火伴久泄脓血等脏腑虚损之疾,黄柏主治肠病、男女生殖系统疾病并能杀虫。此外对古籍中黄芩“除血闭”、黄连“厚肠”、黄柏“洗肝”等三黄主治差异进行罗列。对比分析《伤寒杂病论》中所有涉及“三黄”的条文,黄芩用于柴胡类方、黄连用于白头翁汤等方,黄柏用于栀子柏皮汤等方的组方思路与宋以前本草中“三黄”主治相重合。并结合现有临床及药理研究结果对古籍中三黄主治进行了验证。在临床中选用“三黄”时应多参考以宋以前本草认识,以达到精准用药的目的。

知母黄柏药对对肥胖症大鼠模型降脂作用的实验研究

目的探讨不同剂量的知母黄柏药对(ZB)对高脂饲料诱导肥胖症大鼠的降脂作用及其可能的作用机制。方法雄性SD大鼠62只,随机分为正常组12只,造模组52只。正常组给予普通饲料喂养,造模组以高脂饲料喂养24周;造模第21周,将造模组大鼠随机分为模型组,知母黄柏药对高、中、低剂量组(3.00,1.00,0.33g·kg^(-1)·d^(-1)),盐酸吡格列酮阳性药组(5.25mg·kg^(-1)·d^(-1)),每组各10只。正常组与模型组灌服等体积蒸馏水,其他实验组相应处理,持续22天,于24周末处理大鼠,取血清及肝组织,测量血清甘油三酯(TG),胆固醇(CHO)及总胆汁酸(TBA)水平变化,观察肝组织病理变化(HE染色)。结果与正常组比较,模型组大鼠血清TG、CHO含量均显著升高(P<0.01),血清TBA含量也显著升高(P<0.05);与模型组比较,知母黄柏高剂量组及知母黄柏中剂量组TG、TBA水平均显著降低(P<0.01),盐酸吡格列酮组TG水平显著降低(P<0.05),知母黄柏低剂量组和盐酸吡格列酮组TBA水平显著降低(P<0.01),组织病理显示,知母黄柏药对使各剂量组大鼠肝细胞脂肪变性、气球样变及炎症的程度明显减轻。结论知母黄柏药对不同剂量对肥胖症均具有良好的预防和治疗的作用,其机制可能与改善脂质代谢,调节胆汁酸代谢等有关。

不同中药药对调节氢化可的松药源性证候小鼠肾上腺皮质功能的研究

目的研究不同治法中药配伍调节肾上腺皮质功能的作用。方法小鼠ig给予1.65 mg/(kg·d)氢化可的松14 d诱发药源性证候,同步给予助阳散寒(附子-肉桂)、滋阴泻火(知母-黄柏)、补气生津(人参-黄芪)、补血益精(熟地-山茱萸)4种中药药对干预,检测小鼠体质量、抓力、腋温、旷场活动度、躯体不同部位红外温度等表征信息;取脾脏、胸腺称定质量并计算脏器指数;运用ELISA法检测血清皮质酮、促肾上腺皮质激素(ACTH)、肾上腺素和去甲肾上腺素含量;采用实时荧光定量PCR技术检测肾上腺类固醇合成急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a1)、21-羟化酶(Cyp21a1)、11β-羟化酶1(Cyp11b1)和11β-羟化酶2(Cyp11b2)、酪氨酸羟化酶(Th)、多巴胺脱羧酶(Ddc)、多巴胺β-羟化酶(Dbh)、苯乙胺-N-甲基转移酶(Pnmt)基因表达;运用Western blotting方法检测肾上腺低密度脂蛋白受体(LDLR)、B族I型清道夫受体(SR-BI)、StAR蛋白表达。结果 4种治法对氢化可的松造成的小鼠体质量下降和体温下降效果不显著,附子-肉桂组小鼠抓力显著高于模型组(P<0.05)。与模型组比较,知母-黄柏组小鼠血清皮质酮含量显著升高(P<0.01),StAR、Cyp11b1、Cyp11b2基因表达水平显著升高(P<0.05、0.01),SR-BI、StAR蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。结论滋阴泻火治法寒性药对(知母-黄柏)对小剂量氢化可的松诱发的药源性证候小鼠肾上腺皮质功能的纠正作用最佳。

基于16S rDNA测序技术分析药对知母-黄柏盐炙前后配伍对2型糖尿病大鼠肠道菌群的影响

目的:研究药对知母-黄柏盐炙前后配伍对2型糖尿病(T2DM)大鼠肠道菌群的影响,探讨不同配伍药对防治T2DM与肠道菌群的关系。方法:以100只SPF级雄性SD大鼠为研究对象,从中随机选取10只作为正常对照组,其余采用高脂高糖饮食联合小剂量链脲佐菌素(STZ,45 mg/kg)腹腔注射建立T2DM大鼠模型。造模成功的大鼠随机分为模型对照组、生知母-生黄柏6.48 g/kg组、盐知母-盐黄柏6.48 g/kg组、生知母-盐黄柏6.48 g/kg组、盐知母-生黄柏6.48 g/kg组。T2DM大鼠按6.48 g/kg(按生药量计)每天灌胃各配伍药对水煎液,模型对照组与正常对照组则给予等体积的生理盐水10 mL/kg。造模和给药前后定期监测大鼠空腹血糖及体质量,连续给药30 d后取大鼠粪便。基于16S rDNA高通量测序技术对各组大鼠肠道菌群进行基因测序。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠空腹血糖值(FBG)显著升高(P<0.01),体质量显著降低(P<0.01),并出现明显的肠道菌群紊乱,包括chao1、Shannon、Simpson和PD指数显著降低(P<0.01),及门到属水平下的菌群变化:拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)及乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度明显增加(P<0.01),而厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、Romboutsia及拟杆菌属(Bacteroides)丰度明显降低(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,"知母-黄柏"盐炙前后配伍药对能明显地降低T2DM大鼠血糖水平(P<0.01),增加体质量(P<0.05),提高肠道菌群多样性,增加梭菌纲、Romboutsia及拟杆菌属等有益菌的丰度,降低乳酸杆菌、致病菌芽孢杆菌的丰度,有效调节与改善T2DM大鼠的肠道菌群紊乱,尤以盐知母-盐黄柏6.48 g/kg组效果为最佳。结论:由"知母-黄柏"均盐炙后的配伍药对降低T2DM大鼠血糖水平及改善肠道菌群紊乱的效用更加明显,提示药对盐炙后增效机制可能与其调节肠道微生态相关。