广地龙特异性PCR分子鉴定

【目的】筛选出对广地龙具有特异性鉴别意义的PCR引物,建立一种快速、准确鉴别广地龙基原真实性的方法。【方法】收集药典收载的4种地龙原动物以及市场常见地龙混淆品6种,从Gen Bank数据库中下载有关蚯蚓的12Sr RNA基因序列,采用通用引物对10种样本PCR扩增后进行测序,依其序列间差异设计3对非保守区特异性引物,筛选对广地龙具有特异性扩增的引物。【结果】引物12St/12Sf对广地龙产生特异性扩增,当退火温度提升至64℃时,其反应表现出高度特异性,仅广地龙具有良好的单一扩增带,而其他样品在同样的条件下无扩增带。所得特异性引物在15种市售广地龙药材中验证结果良好,与传统形态学鉴定结果基本一致。【结论】引物12St/12Sf可作为广地龙物种鉴定的特异性标记物,可以实现广地龙近缘多个物种快速而又准确的鉴定,且不受实验材料的完整性、加工干燥等因素的影响。

参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶研究

分离纯化参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶,并对其活性及氨基酸序列进行分析。采用凝胶层析等方法进行蛋白质的分离纯化,SDS-PAGE法进行分子质量的测定,纤维平板法测定纤溶活性,氨基酸自动分析仪分析氨基酸组成,并对一个具有纤溶活性的蛋白酶进行了序列分析。分离纯化得到4种酶,其中EQY-4活性较强,其N-端序列为:Gln-Ile-Gly-Gly-Thr-Asn-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-Phe-Pro-Pro-Gln-Leu-Ser-Gln-Thr。与文献报道中赤子爱胜蚓及粉正蚓中分离得到的蛋白酶对比,主要序列相近,但也有不同。

抗栓用参环毛蚓水提取方法的筛选

目的优选抗栓用参环毛蚓的最佳水提工艺。方法采用L9(34)正交试验法筛选最佳水提条件。结果最佳水提条件为第1次加4倍水,浸泡30 min,第2次加3倍水,浸泡30 min。结论采用本工艺提取参环毛蚓溶栓效价为300 U/g,该工艺稳定、可行。

基于UPLC-Q-TOF-MS技术的广地龙血清药物化学初步研究

目的:对广地龙的血清药物化学进行初步研究。方法:应用超高液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱技术(UPLC-Q-TOF-MS)建立广地龙及其含药血清样品的分析方法;比较体外样品、空白血清及含药血清分析结果,结合Peakview 2.0和Metabolite Pilot 1.5数据分析软件鉴定和表征广地龙血中移行成分。结果:从大鼠含药血清中发现了13个移行成分,包括10个原型成分和3个代谢产物。结论:初步确定了广地龙的血中原型成分及代谢产物,有助于阐明其药效物质基础和作用机理。

HPLC法测定地龙中次黄嘌呤含量

目的:建立稳定可靠的次黄嘌呤含量测定方法。方法:采用稀乙醇浸泡地龙粉末,超声提取,用AlltechApol-loC18色谱柱,水-甲醇(90%:10%)。结果:该方法次黄嘌呤平均回收率为100.3%,RSD=1.9%。结论:结果表明该方法准确可靠,重现性好,结果稳定。

参环毛蚓MT-2基因及启动子的克隆研究

目的揭示参环毛蚓MT-2基因的转录调控机制,为今后采用基因工程技术改良参环毛蚓重金属富集性状奠定基础。方法根据已知的MT-2c DNA序列,设计特异引物,通过PCR扩增参环毛蚓MT-2基因的编码区基因组序列,扩增产物经测序后自行比对分析。基于该序列设计3条特异引物,采用基因步移技术克隆其上游的启动子序列,同时运用Promoter Prediction在线软件分析预测其顺式元件。结果经PCR扩增、测序后获得2 826 bp MT-2基因编码区序列,将该序列与已知MT-2 c DNA序列(登录号为KC787373.1)进行比对,发现MT-2编码区由4个外显子和4个内含子组成。基因步移技术克隆得到1 534 bp的启动子序列,经Promoter Prediction在线软件分析,结果显示该序列不仅含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子软件,还具有3个特异响应重金属参与调控MT-2表达的MRE元件。结论参环毛蚓的MT-2基因能被重金属诱导表达,MT-2基因转录水平的金属调控是通过MT-2基因启动子区的金属调控元件MRE来实现的。

基于UPLC-Q-TOF-MS技术的广地龙化学成分分析

目的建立广地龙药材中化学成分的超高液相色谱-质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)分析方法。方法采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相梯度洗脱,体积流量0.3 m L/min,柱温35℃,正负离子模式扫描。结果共鉴定出广地龙药材中84个化学成分,包括11种游离氨基酸、26种有机酸类、11种核苷类、5种二肽及环二肽类、21种含氮类物质和10种其他类。结论该法准确、快速、灵敏,为进一步阐明其药效物质基础和后期质量控制指标的选择提供科学依据。