通俗环毛蚓、参环毛蚓、赤子爱胜蚓的分子鉴定及纤溶、抗凝活性对比

目的 鉴定参环毛蚓、通俗环毛蚓以及药典外研究较多的赤子爱胜蚓,再比较3种鲜体蚯蚓在两种不同提取方法下的纤溶和抗凝活性,并检测乙醇沉淀物的分子量。方法 采用DNA分子鉴定法鉴别3种蚯蚓。采用水提法提取鲜体蚯蚓蛋白,进一步采用乙醇沉淀法对水提物中的蛋白进行富集,利用纤维蛋白平板法和纤维蛋白原-凝血酶时间法(Fibg-TT法)测定纤溶活性和抗凝活性,利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测3种蚯蚓乙醇沉淀物的分子量。结果 以线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(COI)基因片段为识别片段准确鉴定出了3种蚯蚓。比较3种蚯蚓水提液的抗血栓活性:参环毛蚓水提液的抗凝活性和纤溶活性最强,而赤子爱胜蚓水提液活性最弱;比较3种蚯蚓乙醇沉淀物的抗血栓活性:参环毛蚓乙醇沉淀物的纤溶活性最强,而通俗环毛蚓乙醇沉淀物的抗凝活性最强;赤子爱胜蚓的乙醇沉淀物纤溶和抗凝活性均最弱。参环毛蚓和通俗环毛蚓乙醇沉淀物的蛋白分子量主要分布在25~70 kDa,赤子爱胜蚓乙醇沉淀物的蛋白分子量主要分布在25~40 kDa。结论 药典地龙品种通俗环毛蚓和参环毛蚓的纤溶、抗凝活性远大于药典外的常用品种赤子爱胜蚓,3种蚯蚓中抗血栓活性蛋白有明显差异;乙醇沉淀法可有效富集抗血栓蛋白。

毛细管电泳-大体积样品堆积法测定地龙蛋白粉中地龙多肽

建立了一种简单灵敏的毛细管电泳-大体积样品堆积法同时分离检测4种地龙多肽,方法成功用于地龙多肽VQ-5、OEP3121、F-1及AQ-5的富集。实验中采用了高效毛细管电泳的大体积进样法并对电泳条件进行优化,获得最优条件:堆积电压为-20 kV,堆积时间为2 min,进样压力为20.68 kPa,进样时间为33 s,检测波长为215 nm。实验结果显示,4种地龙多肽可在11 min内完全分离,在各自线性范围内呈现良好的线性,相关系数均大于0.99,富集因子在7.7~30.3之间。将所建立的方法用于地龙蛋白粉中多肽的测定,测得地龙蛋白粉中多肽AQ-5的含量为0.0012%,回收率在91.97%~102.67%之间。该方法简单,快速且准确,适用于实际样品的分析。

广地龙纯化蛋白促进创伤修复作用机制研究

目的:研究广地龙纯化蛋白促进创伤修复的作用机制。方法:采用细胞计数试剂(CCK-8)法,检测给药后对人永生化角质形成细胞(HaCaT)和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)增殖的影响;通过划痕实验,检测HaCaT细胞和NIH3T3细胞迁移的影响;利用羟脯氨酸检测试剂盒和酶联免疫吸附试验法,检测NIH3T3细胞培养上清中羟脯氨酸、胶原蛋白-Ⅰ和基质金属蛋白酶-1水平。结果:在一定范围内,地龙蛋白能促进HaCaT细胞和NIH3T3细胞增殖和迁移,分别在0.313 mg/mL和1.250 mg/mL时,细胞增殖活性最强,划痕愈合率最高;给药后NIH3T3细胞培养上清中羟脯氨酸、胶原蛋白-Ⅰ水平明显升高,基质金属蛋白酶-1水平显著降低,在1.250 mg/mL时,与对照组比较最显著。结论:广地龙纯化蛋白组分通过促进HaCaT细胞和NIH3T3细胞增殖和迁移,促进NIH3T3细胞胶原蛋白合成与分泌,抑制胶原蛋白降解,从而促进创伤修复。

酒炙广地龙的炮制工艺优选及HPLC特征图谱分析

目的:探讨酒炙广地龙的最佳炮制工艺,建立其HPLC特征图谱。方法:采用正交试验,以次黄嘌呤、肌苷、蛋白质及水溶性浸出物含量为评价指标,优选酒炙广地龙的炮制工艺;再按最优炮制工艺制备酒炙广地龙样品,建立其特征图谱。结果:酒炙广地龙饮片炮制过程中,4个因素影响程度依次为:炒制温度>闷润时间>炒制时间>加酒量,最佳炮制工艺为加酒量每100 kg广地龙,黄酒量为15 kg,闷润时间30 min,炒制温度80℃及炒制时间10 min。建立以SETSAIL II AQ-C_(18)柱,流动相甲醇(A)-5 mmol/L磷酸二氢钾溶液(B)梯度洗脱的指纹图谱检测方法,15批酒炙广地龙确定了17个共有峰,指认了次黄嘌呤、尿苷、肌苷、尿嘧啶4个共有峰,相似度为0.974~0.999。结论:次黄嘌呤、肌苷、蛋白质及水溶性浸出物含量4个指标可作为广地龙饮片酒炙炮制过程中的质量评价指标,中试验证评判所得最优炮制工艺合理可行;建立的HPLC特征图谱方法准确可靠,为酒炙广地龙的质量控制和现代研究提供了科学依据。

广地龙的研究进展

广地龙Pheretima aspergillum主要分布于广西、广东,是两广地区的道地药材,为我国常用传统动物中药材。本文通过查阅整理和分析近年来国内外有关广地龙的研究报道,对广地龙的物种鉴定、化学成分、药理作用、质量控制等方面进行归纳总结,为后续对广地龙的进一步研究提供参考依据。

HPLC测定不同产地广地龙中次黄嘌呤的含量

目的:测定不同产地广地龙中次黄嘌呤的含量。方法:采用反相高效液相色谱法,色谱柱:Inertsil ODS- EP柱,流动相:水-甲醇-四氢呋喃(93:7:0．05),流速:1．0 mL／min,检测波长254 nm。结果:次黄嘌呤的平均回收率为98．6％,方法精密度(RSD)为0．50％(n=6)。结论:该法可用于不同产地广地龙中次黄嘌呤的含量测定。

HPLC法测定各沪产地龙和广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶和尿苷的含量

目的测定各种沪产地龙与广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷的含量,建立地龙药材质量评价的方法。方法用0.9%生理盐水超声提取地龙,SORBAX SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm,Aglient Co.,Ltd）,流动相：5mmol/L磷酸二氢钾（pH 2.9）,流速1mL/min,检测波长254nm,柱温30℃,进样量10μL,采用HPLC法,同时测定次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷4种核苷类成分的含量。结果次黄嘌呤的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率99.37%,RSD=1.36%（n=6）;黄嘌呤的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.993 1）,平均回收率91.57%,RSD=1.40%（n=6）;尿嘧啶的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率95.31%,RSD=1.64%（n=6）;尿苷的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率100.21%,RSD=1.98%（n=6）。结论该方法重复性、回收率好,可用于测定地龙与广地龙中次黄嘌呤等4种核苷类成分的含量。

参环毛蚓脂类挥发性成分分析

为了分析参环毛蚓(Pheretimaaspergillum)的脂类成分,我们采用不同溶剂索氏提取法、从该药材得到三种组分,用GC-MS法进行测定,确定了36种化合物的结构。在这三种组分中,乙醚组分中的11种成分均为脂类,不饱和脂肪酸的含量最高,占27.70%,如油酸、亚油酸、花生四烯酸和花生三烯酸。丙酮组分的脂类成分8种,占35.75%,不饱和脂肪酸只有亚油酸一种;乙醇组分的脂类成分13种,占72.09%,没有发现不饱和脂肪酸。本研究确定了参环毛蚓脂肪酸,尤其是不饱和脂肪酸的化学组成,为该中药化学物质基础的研究与药物的开发利用提供了依据。

重金属镉对参环毛蚓胃肠道上皮细胞超微结构损伤的研究

目的:研究不同浓度重金属镉离子胁迫下对参环毛蚓胃肠道结构的影响。方法:采用不同浓度镉离子胁迫参环毛蚓染毒、HE组织切片染色、光学显微镜及透射电镜下观察参环毛蚓胃肠道超微结构损伤的变化。结果:随着镉离子浓度的增加,参环毛蚓的肠道粘膜上皮细胞有大量溶酶体增生,高尔基复合体增生、扩张呈大泡状,微绒毛、纤毛排列不整齐、紊乱,当镉离子浓度达到30mg/kg时,参环毛蚓肠粘膜上皮细胞微绒毛出现萎缩,纤毛细胞出现溃疡坏死病灶,核膜解体、核质外溢,最后导致坏死。结论:参环毛蚓胃肠道粘膜上皮细胞超微结构的受损程度,是随土壤重金属的污染量而定。在较低重金属浓度条件下,参环毛蚓肠上皮细胞是以溶酶体增生、存积一定量的重金属元素的方式来应对其毒害作用,也可视为肠上皮细胞对有毒异物的一种应答反应,为可逆性损伤;而在较高重金属浓度条件下,肠上皮细胞是以微绒毛和线粒体损伤为主,核膜解体、核质外溢,最后导致坏死,为不可逆性损伤。由此推断,参环毛蚓对重金属的高耐受性或富集作用是通过其肠上皮细胞的这种特性来实现的。

参环毛蚓肠道内源性纤维素酶的分离纯化及酶学性质分析

通过对参环毛蚓肠道组织提取液进行DEAE阴离子交换及凝胶过滤层析，获得参环毛蚓单一的内源纤维素酶的活性组分．根据AlpHaEaseFC^TM软件计算出该组分分子质量约为45ku，命名为Cxl．羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethylcellulose，CMC）法对Cxl进行酶学性质分析．分析结果显示：对于底物羧甲基纤维素钠，Cxl的米氏常数（Km）为0．289mg/mL，Vmax为0．446U·mL^-1·min^-1，反应最适温度为55℃，最适pH为6．0，在40～60℃、pH5．0～8．0具有较好的热稳定性和pH稳定性，其相对酶活力都能保持在55％以上．Ag^＋和Ba^2＋对Cxl起显著激活作用，K^＋、Zn^2＋、Mg^2＋、Ca^2＋、NH^4＋、Ni^2＋、Na^＋、Pb^2＋部分抑制酶活性，Cu^2＋离子对Cxl有完全抑制作用，而Fe^2＋对酶活力无明显影响．

广地龙特异性PCR分子鉴定

【目的】筛选出对广地龙具有特异性鉴别意义的PCR引物,建立一种快速、准确鉴别广地龙基原真实性的方法。【方法】收集药典收载的4种地龙原动物以及市场常见地龙混淆品6种,从Gen Bank数据库中下载有关蚯蚓的12Sr RNA基因序列,采用通用引物对10种样本PCR扩增后进行测序,依其序列间差异设计3对非保守区特异性引物,筛选对广地龙具有特异性扩增的引物。【结果】引物12St/12Sf对广地龙产生特异性扩增,当退火温度提升至64℃时,其反应表现出高度特异性,仅广地龙具有良好的单一扩增带,而其他样品在同样的条件下无扩增带。所得特异性引物在15种市售广地龙药材中验证结果良好,与传统形态学鉴定结果基本一致。【结论】引物12St/12Sf可作为广地龙物种鉴定的特异性标记物,可以实现广地龙近缘多个物种快速而又准确的鉴定,且不受实验材料的完整性、加工干燥等因素的影响。

地龙及其注射液指纹特征谱研究

采用薄层扫描法建立了地龙药材及其注射液的指纹特征谱,为控制其质量提供了依据。

十三种神经递质和神经肽在参环毛蚓神经系统的分布:免疫细胞化学研究

选择生活在我国的环节动物门典型代表参环毛蚓 (Pheretimaaspergillum)为研究对象 ,使用 13种抗体 ,运用免疫细胞化学染色技术 ,在光学显微镜下观察神经递质和神经肽阳性细胞的形态与分布。研究发现在参环毛蚓脑 ,ACTH阳性神经细胞、AVP阳性神经细胞、calcitonin阳性神经细胞、CCK阳性神经细胞、glutamate阳性神经细胞和NPY阳性神经细胞染色浓重 ,分布密集 ,位于脑的后侧半 ,尤其特别的是在calcitonin阳性大神经细胞内含有粗大密集的分泌颗粒。β EP阳性神经细胞染色较淡 ,OT阳性神经细胞染色也较深 ,但分布稀疏 ,calbindin D、CGRP、GABA、SOM、VIP呈阴性反应 ;在咽下神经节与腹神经节 ,仅有少量AVP阳性神经细胞、glutamate阳性神经细胞和NPY阳性神经细胞散在分布 ;在肠神经系统 ,β EP阳性神经细胞、CGRP阳性神经细胞、SOM阳性神经细胞、VIP阳性神经细胞染色较深 ,分布散在 ;另外 ,在肠上皮 ,CGRP阳性上皮细胞、cal citonin上皮细胞和VIP阳性上皮细胞呈强阳性反应 ,分布于阴性上皮细胞之间。结果表明参环毛蚓神经系统存在着在其它环节动物所观察到的神经递质和神经肽 :ACTH、VIP、β endorphin、CCK、NPY、CGRP ,亦存在着文献从未报道过的神经递质和神经肽 :calcitonin、AVP、OT、glutamate、SOM ,其?

广地龙中琥珀酸的毛细管电泳电导法测定

目的 建立毛细管电泳电导法测定广地龙中琥珀酸含量的方法。方法 以1．0mmoL／L Tris-10mmoL／L H3BP3-0．5％四乙烯五胺-0．025mmol／L十六烷基三甲基溴化铵为分离介质，使用未涂层融硅毛细管柱（50cm×75μm），分离电压-10kV，电导检测器检测。结果 琥珀酸的线性范围5．00～80．0μg/mL（r=0．9998），平均加样回收率98．4％，RSD=2．2％。结论 该法操作简便，快速。

参环毛蚓细胞原代培养灭菌方法的研究

【目的】选择最佳灭菌方法,建立参环毛蚓细胞原代培养实验体系。【方法】通过4因素和3水平的正交试验法考察不同浓度比例抗生素组合液对参环毛蚓细胞的灭菌效果,比较不同抗生素种类和浓度对参环毛蚓细胞原代培养的影响。【结果】以抗生素组合液200 U/mL青霉素钠+400μg/mL硫酸链霉素+300 U/mL硫酸庆大霉素+5μg/mL两性霉素B对组织块的灭菌效果最佳,10 d污染率为0%,且细胞能保持较好活性,并贴壁生长。【结论】组合式灭菌法是参环毛蚓细胞原代培养的最佳有效灭菌方法,且操作简捷易行。

地龙HPLC指纹图谱分析方法的研究

目的:建立地龙药材指纹图谱的测定方法。方法:采用HPLC法测定地龙药材0.9%生理盐水提取液的指纹图谱。结果:建立了地龙药材HPLC指纹图谱,确定了9个色谱峰为其共有峰。结论:利用地龙药材指纹图谱可以对地龙药材的质量进行全面控制。

参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶研究

分离纯化参环毛蚓中纤溶活性蛋白酶,并对其活性及氨基酸序列进行分析。采用凝胶层析等方法进行蛋白质的分离纯化,SDS-PAGE法进行分子质量的测定,纤维平板法测定纤溶活性,氨基酸自动分析仪分析氨基酸组成,并对一个具有纤溶活性的蛋白酶进行了序列分析。分离纯化得到4种酶,其中EQY-4活性较强,其N-端序列为:Gln-Ile-Gly-Gly-Thr-Asn-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-Phe-Pro-Pro-Gln-Leu-Ser-Gln-Thr。与文献报道中赤子爱胜蚓及粉正蚓中分离得到的蛋白酶对比,主要序列相近,但也有不同。

参环毛蚓对土壤含水量及pH值因子的选择研究

目的考察参环毛蚓对土壤含水量、pH值二因子的选择性，建立其生活所需要的土壤含水量、pH值单因子数学模型。方法在养殖槽内设置不同土壤含水量、pH值区域，由参环毛蚓选择适宜的生活区域。结果参环毛蚓生活适宜的土壤含水量为18.2%-24.6%，pH值为3.7-5.5。结论参环毛蚓选择在湿度适中，偏酸性的土壤中生活；高湿及较干燥，强酸性和碱性的土壤不适宜其生活。

高效毛细管电泳法测定广地龙饮片中琥珀酸的含量

目的测定广地龙饮片中琥珀酸的含量。方法采用高效毛细管电泳法，以未涂层融硅毛细管（50cm×75μm）为分离柱，1mmol／L三（羟甲基）氨基甲烷·10mmol／LH38O3-0．5％四乙烯五胺-0．025mmol／L溴化十六烷基三甲胺（pH=11．45）体系为电泳介质，采用重力进样，进样时间15s，进样高度20cm，分离电压10kV。结果该方法的线性范围为5．00～80．00μg／mL，平均回收率为98．41％，RSD=2．21％（n=9），广地龙饮片（产地：广西）中的琥珀酸含量为0．8mg／g。结论方法可行，重现性好，能有效地控制广地龙饮片的质量。

地龙蛋白组分Ⅲ对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤血管密度和MMP-9表达的影响

目的观察地龙蛋白组分Ⅲ对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤血管密度和MMP-9表达的影响。方法裸鼠接种HNE1细胞形成移植瘤,至肿瘤体积达1cm×1cm×1cm后,随机分为地龙组和对照组,分别于腹腔注射地龙蛋白组分Ⅲ和生理盐水,连续用药20天,然后处死动物,测量鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的体积重量,并制备组织切片,显微镜下计数瘤旁血管密度,免疫组化S-P法检测组织中金属基质蛋白酶9的表达活性。结果地龙组用药处理后,与对照组进行比较,地龙组裸鼠移植瘤的体积和重量均明显降低(P<0.05),瘤旁血管密度明显减少(P<0.05),金属基质蛋白酶9表达明显减弱(P<0.05)。结论地龙蛋白组分Ⅲ可能通过抑制金属基质蛋白酶9的表达活性和抑制瘤旁微血管的生长而抑制鼻咽癌细胞的转移潜能。