Effect of lead on survival, locomotion and sperm morphology of Asian earthworm, Pheretima guillelmi

To provide basic toxicity data for formulating risk characterization benchmarks, the effects of lead on survival, locomotion, and sperm morphology were investigated in the Asian earthworm Pheretima guillelmi. The LC50 of P. guiUelmi for 7 and 14 d were 4285＋339 mg/kg and 3207＋248 mg/kg, which shows P. guillelmi can tolerate a higher concentration of lead nitrate. The average weight of the surviving earthworms decreased at concentration of 2800 mg Pb/kg soil, and the locomotor ability of earthworms exposed to a range of soil Pb concentrations showed a general decrease with increasing Pb concentrations. We also presented data depicting the sperm morphology of earthworms, which shows potential as a sensitive biomarker for measuring the effects of heavy metal on reproduction.

镉诱导威廉环毛蚓（Pheretima guillelmi）金属硫蛋白的分离纯化及特性研究

蚯蚓威廉环毛（ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｇｕｉｌｌｅｌｍｉ）经皮下注射ＣｄＣｌ２溶液诱导后，整体匀浆，再经热沉淀、乙醇沉淀后，经凝胶过滤Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０柱层析，得两个镉结合蛋白峰，分子量依次为４３ｋＤ及１９ｋＤ。这两个组份再分别经ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ柱层析，各得三个镉结合蛋白峰。根据光谱学特征、巯基含量及氨基酸组成等分析，表明凝胶过滤第二峰为金属硫蛋白（ＭＴ），其经ＤＥＡＥ柱层析所得三个峰为ＭＴ三个亚型，Ｎ末端分别为Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｌａ。

威廉环毛蚓中8种核苷提取工艺优化及含量测定

目的优化威廉环毛蚓中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、肌苷、鸟苷、2′-脱氧鸟苷提取工艺,并测定其含量。方法以料液比、超声时间、超声温度为影响因素,次黄嘌呤、总核苷含量为评价指标,正交试验优化提取工艺。HPLC法测定各核苷含量,分析采用Agilent C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相甲醇-水,梯度洗脱;体积流量1 mL/min;柱温30℃;检测波长260 nm。结果最佳条件为料液比1∶250,超声时间30 min,超声温度60℃。8种核苷在各自范围内线性关系良好(R^(2)>0.9990),平均加样回收率99.11%~103.27%,RSD 0.85%~2.89%。结论该方法稳定可靠,可用于威廉环毛蚓中核苷的提取与含量测定。

威廉环毛蚓提取物蛋白质含量测定方法研究

目的 建立威廉环毛蚓提取物蛋白质含量测定的最佳方法。方法 以氨基酸分析仪测定的威廉环毛蚓提取物中的氨基酸含量为指标,对蛋白质含量检测方法 Lowry法2、改良Lowry法、BCA法、Bradford法进行对比评价。结果 Lowry法2、改良Lowry法、BCA法、Bradford法测定威廉环毛蚓提取物蛋白质含量(上清液)结果分别为27.03%、45.85%、31.58%、11.11%,威廉环毛蚓提取物蛋白质含量(混悬液)的结果分别为38.44%、52.39%、44.06%、11.56%。采用氨基酸分析仪法测定得到威廉环毛蚓提取物中游离氨基酸含量为4.18%,将威廉环毛蚓提取物蛋白质酸水解之后测定总氨基酸含量为48.53%。结论 在威廉环毛蚓提取物样品溶液的处理方式上,与样品上清液相比,样品混悬液的测定结果更接近样品中蛋白质的真实含量。以牛血清白蛋白(BSA)为对照品,相较于Lowry法2、改良Lowry法和Bradford法,BCA法更适宜用于威廉环毛蚓提取物中的蛋白质含量测定。

中药地龙提取液的促成骨作用及对实验性牙槽骨吸收疗效的研究

探讨了中药地龙水提液和醇提液有无促进成骨细胞增殖、分化和基质矿化的作用及对大鼠牙槽骨吸收疗效进行了研究.制备地龙的水相及醇相提取液,以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1作为体外药效的试验模型,分别通过MTT法,流式细胞术,碱性磷酸酶活性测定,骨钙素检测和Vonkossa基质矿化染色法观察上述药物的促细胞增殖、分化、基质矿化作用.以实验牙位龈正中注射脂多糖建立的SD大鼠实验性牙槽骨吸收作为体内药效试验模型,通过组织切片形态学骨密度观察和抗酒石酸酸性磷酸酶染色评价上述药物对大鼠实验性牙槽骨吸收的疗效.结果发现:1mg.L-1水提液,0.01mg.L-1和1mg.L-1醇提液能显著促进MC3T3-E1细胞增殖.各浓度的水提液和醇提液均能使S期细胞百分率升高,G1期细胞百分率减少.0.01mg.L-1水提液和1mg.L-1醇提液作用于细胞的第1～3d内、100mg·L-1醇提液作用第7～9d内、100mg·L-1水提液作用第10～12d内可显著提高细胞骨钙素合成和分泌.0.01mg·L-1水提液和醇提液,1mg·L-1水提液可显著促进细胞体外基质矿化.地龙水提液和醇提液组的骨密度均有显著增高,破骨细胞数显著降低.阴性对照组至第30d时牙槽骨仍可见大量破骨细胞.结果表明:地龙水相和醇相提取物中均存在较高活性的促成骨细胞增殖、分化和基质矿化的物质,且对实验性牙槽骨吸收模型有一定治疗作用,可抑制其牙槽骨吸收,促进成骨活动使其修复重建.

威廉环毛蚯蚓对土壤微生物量及活性的影响

探讨威廉环毛蚯蚓(Pheretimaguillelmi)对土壤总微生物量、活性微生物量的影响。蚯蚓处理中(土壤与蚯蚓的比例为5∶1,干重∶活体重,处理时间为24h),用熏蒸提取法测定的土壤总微生物量下降,用底物诱导呼吸法测定的活性微生物量和真菌与细菌比例无显著变化;蚯蚓处理土壤促进了被微生物固持的养分的释放和土壤微生物群体年轻化,增强了微生物的代谢商和纤维素分解活性。结合对文献资料的分析,讨论了土壤微生物量的不同组分对通过蚯蚓肠道的反应。

蚯蚓对连作与轮作西瓜土壤细菌群落、微生物量和酶活性的影响

为了研究蚯蚓对西瓜连作土壤障碍的修复效果,采用盆钵培养西瓜连作与轮作土壤方式,在接种不同密度(0、500条∕m2和1000条∕m2)的威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi)1个月后,分析土壤理化性质、土壤细菌群落多样性与酶活性。结果表明,1)接种蚯蚓均显著提升了障碍土壤EC和降低速效磷,其中1000条∕m2蚯蚓处理还可以显著提升障碍土壤速效氮和速效钾;在轮作土壤中,蚯蚓显著提升了土壤速效磷,降低了土壤EC、有机质、全氮;2)蚯蚓显著提高连作与轮作土壤蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶酶活性,在连作障碍土壤中分别提高了69.4%—108.3%、46.0%—71.8%和41.0%—59.0%,且随蚯蚓接种数量的增加,三种酶活性也均显著提升;3)在连作障碍土壤中,蚯蚓处理后微生物量碳氮分别提高了8.2%—11.4%和68.9%—75.1%,在轮作土壤中,蚯蚓处理后则微生物量碳氮分别降低了18.0%—19.3%和15.7%—16.7%。但不同蚯蚓接种数量之间则没有显著差异;4)蚯蚓处理提高了连作与轮作土壤细菌群落多样性,且1000条∕m2蚯蚓处理高于500条∕m2蚯蚓处理。接种蚯蚓使得连作障碍土壤细菌群落结构逐步趋近于轮作对照处理。综上,在西瓜连作土壤中接种蚯蚓可以显著修复由于连作造成的土壤养分失调、微生物数量降低、细菌群落结构受到破坏等障碍问题,蚯蚓接种密度为1000条∕m2时修复效果优于500条∕m2。

威廉环毛蚓消解牛粪最优条件的研究

采用药用价值高、吞食量大的威廉环毛蚓进行牛粪消解试验,以期在资源再生利用的同时获得更高的经济效益。通过考察pH、温度、湿度和接种密度等4个环境因子对蚯蚓日增重倍数和基质降解速率的影响,研究威廉环毛蚓消解牛粪的最优条件。结果表明:威廉环毛蚓消解牛粪最佳pH为7.0—8.5,温度为20—25℃,湿度为60%—70%,最佳接种密度为蚯蚓与基质质量比1/40。

“花菜-蚯蚓”种养模式对杂草发生的影响及除草剂对蚯蚓的急性毒性评价

为了摸清蚯蚓活动对杂草发生的影响以及除草剂对蚯蚓的急性毒性,2017年-2019年连续3年调查了“花菜-蚯蚓”种养模式下田间杂草物种数、总草密度和生物量,同时测定了17种除草剂对威廉环毛蚓的急性毒性。结果表明,与花菜单一种植模式相比,“花菜-蚯蚓”种养模式显著降低了田间杂草物种数、总草密度和生物量,减轻了杂草危害。不同除草剂对威廉环毛蚓的急性毒性存在较大的差异。采用滤纸法处理48 h,丙草胺、高效氟吡甲禾灵和噁唑酰草胺对威廉环毛蚓的急性毒性最高,LD_(50)分别为1.1、1.8μg/cm^(2)和7.1μg/cm^(2)。其次为灭草松,LD_(50)为70.3μg/cm^(2)。乙羧氟草醚、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮、嘧啶肟草醚和烟嘧磺隆对威廉环毛蚓的急性毒性相对较低,LD_(50)均大于1200μg/cm^(2)。采用人工土壤法处理14 d,灭草松对威廉环毛蚓的急性毒性最高,LD_(50)为50.3 mg/kg。其次为二甲戊灵、草铵膦和丙草胺,LD_(50)分别为111.9、137.4 mg/kg和169.5 mg/kg。双草醚、氰氟草酯、硝磺草酮和苯唑草酮对威廉环毛蚓的急性毒性相对较低,LD_(50)均大于500 mg/kg。基于滤纸法和人工土壤法的测定结果,丙草胺、灭草松、噁唑酰草胺、高效氟吡甲禾灵、草铵膦和二甲戊灵对威廉环毛蚓具有相对较高的急性毒性,不建议用于“作物-蚯蚓”种养农田防除杂草。

沪地龙的原动物鉴定

对“沪地龙”原动物的分类学鉴定结果表明,其来源于钜蚓科动物通俗环毛蚓Pheretimavulgaris、威廉环毛蚓P.guillelmi或栉盲环毛蚓P.pectinifera的干燥体。此项结果已被中国药典(1995年版)一部收载。

两种生态类型蚯蚓血液蛋白质组分电泳分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对不同生态类型的微小双胸蚓(Bimastus parvus)和威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi)血液蛋白质进行分离比较。结果表明,威廉环毛蚓血液蛋白质电泳扩增出6条条带,微小双胸蚓血液蛋白质电泳扩增出5条条带,表栖型的微小双胸蚓比内栖型的威廉环毛蚓少了一个组分。形成血液蛋白质组分的差异性可能与蚯蚓生态适应性有关。

10种稻田常用杀菌剂对蚯蚓的急性毒性效应

为评估不同杀菌剂对蚯蚓的毒性,采用人工土壤法和自然土壤法测定了10种稻田常用杀菌剂(嘧苷素、井岗霉素、噻呋酰胺、宁南霉素、甲基硫菌灵、稻瘟灵、蜡芽菌、氟环唑、戊唑醇和三环唑)对威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi)的急性毒性效应。结果表明:随着染毒时间的延长,10种稻田常用杀菌剂对威廉环毛蚓的急性毒性作用增加。采用人工土壤法染毒14 d时,10种稻田常用杀菌剂对威廉环毛蚓的LC_(50)值为9.79—250.68 mg/kg。采用自然土壤法染毒14 d时,甲基硫菌灵、稻瘟灵和戊唑醇对威廉环毛蚓的LC_(50)值为4.10—9.65 mg/kg,均小于10 mg/kg;其余7种杀菌剂的LC_(50)值在30.67—244.29 mg/kg。根据《化学农药环境安全评价试验准则》,甲基硫菌灵、稻瘟灵和戊唑醇对威廉环毛蚓属于中毒级,噻呋酰胺、氟环唑、三环唑、嘧苷素、蜡芽菌、井冈霉素、宁南霉素对威廉环毛蚓属于低毒级。

不同生活型蚯蚓对污泥处理的效果研究

研究报道了三种不同种蚯蚓接种后污泥的处理效果。28天的培养实验表明:接种蚯蚓,特别是体型较大的威廉环毛蚓和杜拉蚓能提高污泥的p H值,减少污泥中有机物的含量。接种蚯蚓减少了污泥中全氮、全磷、全钾的含量,深层种杜拉蚓显著降低了污泥中全氮和全磷含量,较对照处理分别减少了14.3%和10.3%。接种威廉环毛蚓的处理较对照处理能显著增加水解性氮和速效钾的含量。接种杜拉蚓的处理吸收重金属的效果最佳,Cr和Cu含量均显著低于对照处理,威廉环毛蚓次之,但优于赤子爱胜蚓。结果显示,在大部分项目中,杜拉蚓和威廉环毛蚓的作用效果是要优于赤子爱胜蚓,不同生活习性的蚯蚓对污泥净化效果会有着一定的不同。

基于UPLC-Q-Exactive-MS及多种技术研究威廉环毛蚓提取物化学成分组成

目的对威廉环毛蚓Pheretima guillelmi提取物中化学成分和蛋白质、游离氨基酸、脂质、总糖、多种元素、水分、灰分及硫酸铵等成分进行质量分数测定。方法采用UPLC-Q-Exactive-MS技术探究威廉环毛蚓提取物化学组成;采用仲裁法--凯氏定氮法对蛋白质质量分数进行测定;采用索氏抽提法测定脂质的质量分数,采用皂化及甲基化法测定各脂肪酸的质量分数;采用ICP-MS及ICP-OES技术测定23种元素的质量分数;采用《中国药典》2020年版中烘干法和总灰分测定法测定水分和总灰分的质量分数;采用离子色谱法测定硫酸铵的质量分数。结果共鉴定出54种化学物质,主要为氨基酸类、核苷类及有机酸类等成分;蛋白质的质量分数为53.01%,游离氨基酸为4.18%;脂质为5.62%,其中总脂肪酸质量分数为1.23%;Mo、Se、As、V、Mn、Co、Ni、Pb、Sn、Cd、Cr、Cu、Li、B、Fe、Zn、Al、K、Ca、Mg、Na、Hg、Si等元素质量分数分别为2.65、4.88、2.31、1.12、25.2、8.32、2.39、1.59、0.0572、9.27、43.7、27.7、0.642、1.33、759、185、245、614、3.28×10^(3)、970、1.32×10^(3)、0.191、433 mg·kg^(-1);总糖质量分数为11.42%;水分4.05%、总灰分2.36%;硫酸铵9.89%。结论基本确定威廉环毛蚓提取物中大部成分组成。

沪地龙抗凝血活性部位分离研究

目的从沪地龙中分离纯化抗凝血活性部位。方法以抗凝活性为筛选指标,以Sephadex G50、DEAE Cellulose-52、Sephadex LH-20等进行分离、纯化。结果从沪地龙热提取液中分离得到3个活性部位。结论地龙中存在多个不同活性的体外抗凝血活性部位。

地龙的多重位点特异性PCR鉴别

目的:近年来,中药材地龙的商品价格不断上涨,市场的混伪品随之增加。其主要鉴别特征在药材中大部分丢失,难以区分。因此,急需建立一种准确、稳定的中药材地龙基原鉴别方法。方法:根据地龙及其混伪品的COI基因序列差异找到变异位点,从而设计参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,优化反应体系并进行耐受性和适用性的考察和验证。在此基础上将特异性引物组合,构建多重聚合酶链式反应(PCR)体系,从而建立了一种高效准确、操作简便、专属性强、重复性好的中药材地龙及其常见混伪品的多重位点PCR鉴别方法。结果:在该方法下广地龙基原参环毛蚓可得到366 bp片段,沪地龙基原通俗环毛蚓和威廉环毛蚓可得到487 bp片段,栉盲环毛蚓可得到475 bp片段,其他混伪品均无条带。将之组合形成的多重PCR可在一次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别沪地龙和广地龙。结论:该文所建立的多重位点特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中药材地龙真伪。

地龙抗凝血活性体外评价方法的建立

目的建立一种基于全自动血凝分析仪测定纤维蛋白原-凝血酶时间的地龙及其相关制剂的抗凝血活性的体外评价方法。方法以威廉环毛蚓提取物为研究对象,采用BCA蛋白测定法测定可溶性蛋白含量,以抗凝血活性为指标,建立纤维蛋白原-凝血酶时间法测定活性,以活性浓度与可溶性蛋白浓度的比值(比活)作为活性评价指标。结果10批地龙提取物可溶性蛋白含量为(26.56±3.57)%,比活为(34.64±3.98)U·μg^-1。其比活大小与蚓激酶标准品(43.60 U·μg^-1)相当,且是市售蚯蚓酶(22.17 U·μg^-1)比活的1.5倍。结论采用BCA蛋白测定法测定地龙提取物可溶性蛋白,方法简便、可靠;所建立的纤维蛋白原-凝血酶时间法,操作简便,人为影响因素小,结果客观准确,可用于实时测定,重复性和仪器精密度良好,线性范围较广,具有可行性,可用于地龙及其制剂活性的评价。