威廉环毛蚓中8种核苷提取工艺优化及含量测定

目的优化威廉环毛蚓中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、肌苷、鸟苷、2′-脱氧鸟苷提取工艺,并测定其含量。方法以料液比、超声时间、超声温度为影响因素,次黄嘌呤、总核苷含量为评价指标,正交试验优化提取工艺。HPLC法测定各核苷含量,分析采用Agilent C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相甲醇-水,梯度洗脱;体积流量1 mL/min;柱温30℃;检测波长260 nm。结果最佳条件为料液比1∶250,超声时间30 min,超声温度60℃。8种核苷在各自范围内线性关系良好(R^(2)>0.9990),平均加样回收率99.11%~103.27%,RSD 0.85%~2.89%。结论该方法稳定可靠,可用于威廉环毛蚓中核苷的提取与含量测定。

土壤Cu、Cd污染对两种蚯蚓种的急性毒性

通过室内模拟重金属Cu、Cd污染实验,测定了在黄泥土条件下赤子爱胜蚓和威廉环毛蚓的急性毒性效应以及体内累积量.结果表明,赤子爱胜蚓体内Cd累积量与土壤Cd浓度呈显著正相关,赤子爱胜蚓和威廉环毛蚓体内Cu累积量在土壤Cu浓度200～392mgkg-1时呈上升趋势,在Cu浓度392～1075.6mgkg-1时呈下降趋势;威廉环毛蚓体内Cd累积量在土壤Cd浓度200～548.8mgkg-1时呈上升趋势,在Cd浓度548.8～1505.8mgkg-1时呈下降趋势.赤子爱胜蚓和威廉环毛蚓的LC50(Cu)分别为387～555mgkg-1和412～653mgkg-1,LC50(Cd)分别为809～1138mgkg-1和708～1030mgkg-1.总体来看,威廉环毛蚓对重金属Cu的累积能力以及耐受性均强于赤子爱胜蚓,而赤子爱胜蚓对Cd的耐受性强于威廉环毛蚓,但累积能力低于威廉环毛蚓.

两种生态类型蚯蚓几种消化酶活性比较研究

蚯蚓在有机残体转化和土壤养分循环中起着重要的作用 ,为明确不同生态类型蚯蚓的食性及其消化有机物质的能力 ,测定了表居型蚯蚓赤爱胜蚓 ( Eisenia fetida)和上食下居型蚯蚓威廉环毛蚓 ( Pheretima guillemi)肠道内纤维素酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性 ;同时还对威廉环毛蚓排泄物中蛋白酶、磷酸酶以及 CO2 呼吸强度与原土进行了比较。结果表明 ,赤爱胜蚓肠道内纤维素酶活性远远高于威廉环毛蚓 ,而蛋白酶和酸性及碱性磷酸酶活性显著低于威廉环毛蚓 ;两种蚯蚓肠道消化酶活化的差异与赤爱胜蚓直接以植物残体为食 ,而威廉环毛蚓以半分解的有机残体上的微生物为食有关。根据研究结果 ,提出了饲养环毛蚓时要注意增加饵料中微生物量的观点。

基于磁珠配体垂钓和液相色谱-质谱联用技术的威廉环毛蚓抗血栓大分子活性成分研究

目的通过构建靶蛋白固定化磁珠,从威廉环毛蚓Pheretima guillemi中垂钓出与靶蛋白(纤维蛋白原、纤溶酶原)直接作用的抗血栓活性大分子成分,并经液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定。方法优化并合成纤维蛋白原、纤溶酶原固定化羧基磁珠,分别通过固定化量、透射电镜、傅里叶红外光谱仪、激光纳米粒度分析仪表征功能化磁珠的靶蛋白固定量、微观形态、官能团及表面带电性;利用功能化磁珠从威廉环毛蚓抗血栓部位DPf3中垂钓与靶蛋白直接作用的抗血栓大分子活性成分,洗脱后经LC-MS/MS技术分析,并结合威廉环毛蚓物种蛋白质数据库比对鉴定。结果靶蛋白固定化磁珠的最佳制备方案为将纤维蛋白原(0.4 mg/mL)或纤溶酶原(1 mg/mL)与磁珠于4℃混旋孵育8 h,纤维蛋白原和纤溶酶原的最大偶联量分别为(9.84±2.17)μg/mg和(7.24±0.91)μg/mg;经表征,靶蛋白均已成功固定于磁珠表面。DPf3经纤维蛋白原、纤溶酶原固定化磁珠垂钓所得洗脱液经扫描比对,分别鉴定到20种和27种蛋白质,多属于丝氨酸蛋白酶类成分。结论通过磁珠配体垂钓策略和LC-MS/MS技术可从威廉环毛蚓中快速筛选和鉴定目标生物活性大分子,可为动物类中药大分子的分离鉴定提供参考。

基于UPLC-Q-Exactive-MS及多种技术研究威廉环毛蚓提取物化学成分组成

目的对威廉环毛蚓Pheretima guillelmi提取物中化学成分和蛋白质、游离氨基酸、脂质、总糖、多种元素、水分、灰分及硫酸铵等成分进行质量分数测定。方法采用UPLC-Q-Exactive-MS技术探究威廉环毛蚓提取物化学组成;采用仲裁法--凯氏定氮法对蛋白质质量分数进行测定;采用索氏抽提法测定脂质的质量分数,采用皂化及甲基化法测定各脂肪酸的质量分数;采用ICP-MS及ICP-OES技术测定23种元素的质量分数;采用《中国药典》2020年版中烘干法和总灰分测定法测定水分和总灰分的质量分数;采用离子色谱法测定硫酸铵的质量分数。结果共鉴定出54种化学物质,主要为氨基酸类、核苷类及有机酸类等成分;蛋白质的质量分数为53.01%,游离氨基酸为4.18%;脂质为5.62%,其中总脂肪酸质量分数为1.23%;Mo、Se、As、V、Mn、Co、Ni、Pb、Sn、Cd、Cr、Cu、Li、B、Fe、Zn、Al、K、Ca、Mg、Na、Hg、Si等元素质量分数分别为2.65、4.88、2.31、1.12、25.2、8.32、2.39、1.59、0.0572、9.27、43.7、27.7、0.642、1.33、759、185、245、614、3.28×10^(3)、970、1.32×10^(3)、0.191、433 mg·kg^(-1);总糖质量分数为11.42%;水分4.05%、总灰分2.36%;硫酸铵9.89%。结论基本确定威廉环毛蚓提取物中大部成分组成。

基于指纹图谱和化学计量学研究沪地龙基原间质量差异

目的 应用指纹图谱和化学计量学分析方法,比较沪地龙药材基原(通俗环毛蚓Pheretima vulgaris、威廉环毛蚓P.guillelmi或栉盲环毛蚓P. pectinifera)间质量差异,筛选差异性标志物,为建立沪地龙质量标准提供参考。方法 应用高效液相色谱法建立沪地龙水溶性成分指纹图谱,运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件比较相似度;应用聚类分析、正交偏最小二乘判别分析和主成分分析法对3个基原间所测得的6种水溶性成分含量进行比较分析,并依据主成分得分对各批次样本进行综合性评价。结果 相似度评价结果,通俗环毛蚓与威廉环毛蚓的相似度为0.987;栉盲环毛蚓与通俗环毛蚓的相似度为0.697,与威廉环毛蚓的相似度为0.717。聚类分析方法不能区分3个基原。正交偏最小二乘判别分析结果显示,通俗环毛蚓和威廉环毛蚓不能区分,但二者能与栉盲环毛蚓区分,差异性成分为尿苷和鸟苷。主成分分析综合评分共有19批样本大于平均分值,其中栉盲环毛蚓11批、通俗环毛蚓6批、威廉环毛蚓2批;产地为上海市13批,江苏省2批,浙江省1批,安徽省2批。结论 沪地龙3个基原间存在差异,其中通俗环毛蚓与威廉环毛蚓在水溶性成分种类和含量方面相似度高,但二者均与栉盲环毛蚓存在差异。

沪地龙3个基原的多重位点特异性PCR鉴别

目的沪地龙3个基原药材(通俗环毛蚓Pheretima vulgaris、威廉环毛蚓P.guillelmi、栉盲环毛蚓P.pectinifera)在外观性状方面相似度高,传统鉴定方法难以有效区分,通过建立多重位点特异性PCR方法同时鉴别沪地龙3个基原。方法通过比对沪地龙和其他7个蚯蚓品种线粒体全基因序列的多态性位点差异,分别设计通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,建立单基原反应体系,并对耐受性和适用性进行考察和验证;而后优化特异性引物组合,构建多重位点特异性PCR鉴别体系;反应体系为25μL:2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL,引物1.5μL(通俗环毛蚓∶威廉环毛蚓∶栉盲环毛蚓=1∶1.2∶0.8),DNA模板0.5μL(50 ng/μL),灭菌水补足至25μL。PCR扩增条件:95℃预变性4min;95℃变性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸20 s,循环33次;产物末端72℃延伸7 min。结果通俗环毛蚓可得到535 bp条带,威廉环毛蚓可得到219 bp条带,栉盲环毛蚓可得到435 bp条带,其他品种蚯蚓样品均无条带。结论多重位点特异性PCR鉴别体系可根据条带位置同时鉴别沪地龙3个基原。该方法可用于沪地龙基原和真伪鉴别,并为地龙的质量控制和研究提供参考。