大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测技术的建立

[目的]应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的简便、快速和灵敏的大豆茎褐腐病菌[Phialophora gregata f.sp.sojae(PGS)]检测方法。[方法]利用LAMP技术,以ITS为靶序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,在此基础上建立了检测大豆茎褐腐病菌的LAMP体系。[结果]整个检测过程仅需1 h就可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化可以判断PGS的存在与否。特异性试验中,大豆茎褐腐病菌菌株DNA扩增后HNB呈天蓝色的阳性反应,而在其他大豆常见病害的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。在灵敏度试验中,ITS-LAMP技术最低检测限为10 pg·μL-1,对于进口大豆残体样本中PGS的检测灵敏度为每10 g大豆植株残体50个孢子。[结论]该方法的建立为检疫性病害大豆茎褐腐病菌的检测提供了新的技术平台,符合我国口岸对大豆茎褐腐病菌快速检测的迫切需要。