伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备

目的:为深入研究伤寒沙门菌调节因子phoP的功能,制备伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株。方法:根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在5′末端加接酶BglII位点,PCR扩增phoP基因上、下游片段后,用BglII消化,再定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后并导入自杀质粒pG-MB151的BamHI位点,将阳性质粒用电转化导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。结果:PCR及序列分析证实,缺陷变异株的phoP基因缺失297个碱基。结论:成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。

利用基因芯片筛选禽致病性大肠杆菌中与phoP/Q二元调控系统相关的耐药基因

为筛选禽致病性大肠杆菌(APEC)中与phoP/Q二元调控系统相关的耐药基因表达谱情况并对耐药相关基因进行分析,本实验采用基因芯片技术对APEC野生株和△phoP/Q基因缺失突变株进行转录组的差异性比较,结果检测到713个差异表达基因,其中403个基因的表达水平上调,310个基因的表达水平下调。这些基因涉及生物过程、细胞组分、蛋白质分类及调控通路等功能,本研究着重从上述差异基因中筛选出了aphA、parE等耐药相关的功能基因。本研究对phoP/Q二元调控系统与APEC耐药调控的相关性进行了探索与分析,为进一步深入探寻APEC耐药性的调控机制提供了新的切入点与研究靶标。

OmpR与PhoP高渗应激下交叉调节伤寒沙门菌基因表达

为了探寻OmpR和PhoP之间的交叉调节关系,构建了ompR-phoP双缺陷变异株,运用基因芯片分析技术比较了伤寒沙门菌ompR缺陷株、phoP缺陷株及ompR-phoP双缺陷株之间基因表达谱的差异.结果显示OmpR与PhoP共同激活11个基因的转录,主要为外膜孔蛋白相关基因、脂多糖修饰相关基因等,两者在调节特定的膜蛋白、孔蛋白及表面结构成分的表达水平方面发挥着协同作用,OmpR与PhoP对未知功能蛋白基因t0563、t0564也具有协同激活效应,值得进一步关注.OmpR与PhoP共同抑制nanT的转录,阻止唾液酸的转运.另外,ompR缺陷株和phoP缺陷株中未见变化,而ompR-phoP双缺陷变异株中差异表达基因也可能是OmpR和PhoP的共同调节元,但需要进一步验证.

禽致病性大肠杆菌双组分系统phoP/Q对鞭毛Ⅲ型分泌系统基因的调控预测

本研究旨在探究禽致病性大肠杆菌(APEC)中双组分系统phoP/Q与鞭毛Ⅲ型分泌系统(鞭毛T3SS)蛋白之间的联系。运用软件进行功能分析,预测phoP/Q与鞭毛T3SS的关系,利用基因芯片技术对APEC野生株和ΔphoP/Q缺失突变株进行转录组的差异性比较,筛选鞭毛T3SS基座中变化较大基因,并用荧光定量PCR检测基因表达变化量。结果显示:经STRING预测发现phoP/Q可能通过调控鞭毛T3SS基因座附近的双组分系统来间接调控鞭毛T3SS。基因芯片筛选与荧光定量PCR检测发现phoP/Q缺失能使鞭毛T3SS核心组件的大部分基因表达差异显著,同时也影响了双组分中motA、motB与cheY的表达。本研究对phoP/Q双组分系统与鞭毛T3SS的关系进行了预测与探索,为进一步研究揭示细菌的活动与致病机制提供了新的切入点与研究方向。

PhoP/PhoR基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv的构建及鉴定

目的构建PhoP和PhoR基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv（以下简称H37Rv）,检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv菌株PhoP/PhoR基因的表达水平。方法提取并鉴定结核分枝杆菌重组穿梭质粒pMV361-PhoP和pMV361-PhoR,利用电转化技术将结核分枝杆菌重组穿梭质粒pMV361-PhoP和pMV361-PhoR导入H37Rv的感受态细胞中,构建PhoP/PhoR基因过表达H37Rv,应用实时荧光定量PCR检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达水平。结果成功构建PhoP/PhoR基因过表达H37Rv。应用实时荧光定量PCR检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达水平,其中在电压为2 300～2 500V的范围内,电压越高,电转化菌的PhoP/PhoR基因表达量越高。结论成功构建了PhoP/PhoR基因过表达H37Rv菌株,以电压为2 500V电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达量较高。

结核分枝杆菌PhoP蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学软件预测结核分枝杆菌PhoP基因编码蛋白的结构和功能。方法从NCBI数据库获取PhoP基本的基因信息及其编码序列氨基酸信息;应用ProtParam软件预测PhoP蛋白的理化性质;利用SignalIP4.1和TMHMM分析其信号肽和跨膜区;利用在线分析Expasy工具分析蛋白二级结构,建立蛋白三级结构模型;采用Bepipred 1.0Server和SYFPEITHI分析蛋白的B细胞及T细胞抗原表位。结果 PhopP蛋白共250个氨基酸,分子式为C1226H1974N346O364S4,原子总数3 914,半衰期为30h,预测该蛋白为稳定性亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋、β-转角、β-折叠、无规则卷曲分别占36.03%、10.58%、24.7%和27.94%,预测的B细胞、CTL细胞抗原表位分别为21个和7个;PhoP基因与天蓝色链霉菌同源性较高;其编码蛋白的相互作用蛋白为PhoR、senX3、trcS等。结论生物信息学分析PhoP为稳定蛋白,且含有潜在的B、T细胞抗原表位,是结核病诊断及治疗的潜在候选因子。

鸟分枝杆菌PhoP功能分析及其基因突变株的构建

【目的】对鸟分枝杆菌PhoP的功能进行分析及构建PhoP基因突变株,为深入研究PhoP的调控机制打下基础。【方法】利用PCR扩增出鸟分枝杆菌PhoP DNA结合区(PhoPC)编码序列,与表达载体p GEX-4T-3连接后,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-PhoPC融合蛋白。用凝血酶去除GST标签,制备PhoPC蛋白;利用PCR扩增出鸟分枝杆菌PhoP基因及其下游基因MAV0127、PhoU和Amt的启动子片段,采用凝胶迁移率移动试验(EMSA)分别检测PhoPC与PhoP、MAV0127、PhoU和Amt的启动子结合的情况。通过PCR扩增PhoP基因上、下游片段,构建PhoP基因缺失性同源核苷酸片段,与自杀质粒p GMB151连接后,通过电转化导入鸟分枝杆菌进行同源交换,利用PCR筛选出PhoP基因缺失突变株。【结果】EMSA结果显示,鸟分枝杆菌PhoP能与PhoP、MAV0127及Amt基因启动子结合,不能与PhoU结合。通过PCR和序列分析证实基因突变株的PhoP基因缺失了309个碱基。【结论】PhoP不仅可调控其下游基因MAV0127和Amt的转录水平,还可调控其自身基因的转录,但不参与调节PhoU二元调控系统。构建了PhoP基因缺失突变株,为进一步研究其在鸟分枝杆菌的调控功能奠定了基础。

铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

目的分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因序列并确定该系统与耐药性关系。方法采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ和phoP基因片段，T—A克隆后测序。构建phoQ和phoP基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rPhoQ和rPhoP，皮内注射免疫法制备兔抗血清，免疫双扩散法测定抗血清效价。采用Red重组系统敲除氨基糖苷类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株phoQ基因，采用PCR、测序和Westernblot对phoQ。突变株进行鉴定。采用试管稀释法测定各铜绿假单胞菌野生株和突变株对4种氨基糖苷类抗，丰素的最低抑菌浓度（MIC）。结果与GenBank中相关序列比较，所克隆的phoP和phoQ基因核苷酸和氨基酸相似性分别为98．7％一99．6％和98．7～100％、98．4％～99．8％和99．1％～100％。采用pET-42a和E．coliB121DE3系统成功地表达了rPhoQ和rPhoP。rPhoQ和rPhoP兔抗血清免疫双扩效价分别为1：4和1：8抗血清。经PCR、测序和Westernblot鉴定，两株phoQ^-突变株phoQ基因及产物均缺失。上述phoQ^-突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC值分别为其野生株的1／512～1／2048。结论PhoQ／PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号转导系统，该系统介导细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性。