PhoPR双组份系统在结核分枝杆菌致病机制中的研究进展

双组份信号转导系统(Two-component signal transduction system,TCS)广泛存在于原核生物细胞内,对细胞生长、分化、代谢、毒力、持留性、致病性等方面的调控发挥着重要作用。PhoPR TCS作为双组份系统中最基本、最重要的感应外界环境变化,并作出相应反应的调控系统,能够调控结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,MTB)更好的适应宿主微环境变化。因此PhoPR TCS作为MTB适应环境变化的重要调控系统已愈来愈受关注,关于PhoPR TCS在MTB的致病机制调控方面的研究正在成为新的热点。

利用融合PCR技术和T载体克隆技术构建结核分枝杆菌PhoPR双组份系统缺失突变载体

目的基于融合PCR技术(SOE-PCR)、T载体克隆技术,构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)双组份系统缺失突变载体的方法。方法利用SOE-PCR技术,将PhoP、PhoR和PhoPR基因上、下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合,构建PhoP、PhoR和PhoPR突变片段,然后将突变片段直接与T载体连接,将其转入E.coli DH5α感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得MTB PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变载体。结果成功构建MTB PhoPR双组份系统缺失突变载体,与传统方法相比,效率高、周期短。结论基于融合PCR技术和T载体克隆技术成功构建MTB PhoPR双组份系统缺失突变载体,为下一步构建MTB突变株以及相关研究奠定基础。

黄连总生物碱对结核菌PhoPR双组份系统基因转录水平影响的研究

为研究黄连总生物碱对结核菌Pho PR双组份系统基因转录水平的影响,对不同药物作用的菌液提取总RNA并进行反转录,根据Gen Bank中H37Rv的Pho P(0757)基因、PhoR(0758)基因和Sig A的基因序列,应用Primer6.0软件设计荧光定量引物并进行荧光定量PCR分析。结果显示:在高浓度黄连生物碱作用时,多药耐药结核菌MT-7、MB-1的Pho P和PhoR的基因的表达水平明显下降,并且黄连总生物碱与RPF联合作用时,多药耐药结核菌MT-7、MB-1的Pho P和PhoR的基因的表达水平明显下降,表明黄连生物碱是RFP抗菌增效剂。本试验为结核菌抗菌增效作用机制研究奠定了理论基础。

粪肠球菌牙本质黏附及其影响因素的研究进展

粪肠球菌是难治性根尖周炎(refractory apical periodontitis,RAP)的主要致病菌,该细菌可耐受严苛环境,引发根尖周免疫炎症反应,造成根管内外持续性感染。粪肠球菌黏附于根管牙本质壁形成生物膜,其耐药和抗冲刷能力显著增强,是介导其致病的关键因素。粪肠球菌与牙本质的黏附包括非特异性和特异性黏附,后者由黏附相关毒力因子介导,主要包括肠球菌胶原结合蛋白(adhesin of collagen from enterococci,Ace)、表面蛋白(extracellular surface protein,Esp)、明胶酶(gelatinase,GelE)和丝氨酸蛋白酶(serine prtease,SprE)、菌毛以及聚集物质,且受到多个双组份系统调控。Fsr双组份系统在群体密度增加时可以促进gelE及sprE的表达,GelE进一步减少表面肠球菌胶原结合蛋白Ace,而GrvRS双组份系统则在响应血清环境时直接下调ace的表达。CroRS双组份系统及WalRK双组份系统也可能分别促进和抑制包括ace及gelE在内的多种毒力因子的表达,进而影响粪肠球菌的黏附性。此外,根管机械/化学预备、根管内环境因素等均可对粪肠球菌牙本质黏附产生影响。根管治疗中避免粪肠球菌的引入和使用干扰黏附的药物可以有效预防粪肠球菌的黏附,而多种活化荡洗方法也可以有效增加根管内粪肠球菌的清除率。针对粪肠球菌牙本质黏附关键因子与调控因素为靶点设计合理药物,有望为根管感染控制提供新的思路与手段。本文就粪肠球菌与牙本质的黏附性及其影响因素进行综述。

srtA基因调节变异链球菌氧化耐受的机制研究

目的探究srtA基因对变异链球菌氧化耐受能力的调节作用并初步探讨其机制。方法通过氧化耐受实验,对比变异链球菌UA159菌株及其srtA基因缺失株及回复株在浮游及生物膜状态下的氧化耐受能力差异;用Illumina Hiseq 4000测序平台对UA159菌株及其srtA基因缺失株在对数中期及稳定期的基因转录组测序,比较其氧化耐受相关基因的转录表达差异,进一步探讨srtA基因缺失后变异链球菌氧化耐受能力的变化与其基因转录组的内在联系;并采用qPCR来验证相关基因表达水平的变化。结果srtA基因缺失后变异链球菌在浮游状态、生物膜状态的氧化耐受能力均较UA159降低(P<0.05)。分析33个氧化耐受相关基因在转录组测序结果中的表达水平发现,过氧化物合成与代谢相关酶类基因无明显变化,但稳定期样本中双组份信号转导系统编码基因lrgA、lrgB、lytT表达下调2.2~2.4倍;qPCR结果进一步表明对数中期、稳定期的浮游菌lrgB、lytT表达下调11.01~53.51倍,且另一双组分系统编码基因vicK表达下调6.57~10.88倍(P<0.001)。结论srtA基因缺失后,变异链球菌过氧化物合成及代谢酶类编码基因表达水平不变,但氧化耐受相关转录调节因子表达水平下降,进而减弱变异链球菌的氧化耐受能力。