黄芪多糖上调γH2AX的表达提高宫颈癌细胞放疗敏感性的分析

目的研究黄芪多糖(APS)对宫颈癌Siha细胞增殖能力的影响,观察放疗后磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的表达情况。方法体外培养Siha细胞,将其分为两组即放疗组和APS联合放疗组。应用CCK8法检测不同浓度APS对Siha细胞增殖活性的影响;Western blotting检测放疗4 h后两组γH2AX蛋白的表达水平。结果APS浓度越高,细胞的增殖活力越弱;APS作用时间越长,细胞增殖能力越弱(P<0.01);放疗后,APS联合放疗组γH2AX表达水平高于放疗组(P=0.031)。结论APS可以抑制Siha细胞增殖,促进γH2AX表达,从而提高放疗的敏感性。

与细胞周期G_2/M期进程相关的H2AX磷酸化

γH2AX焦点(foci)被普遍当做DNA双链断裂(DSB)损伤的分子标志物.为探讨细胞周期进程相关的H2AX磷酸化规律特征,采用胸腺嘧啶双阻滞结合噻氨酯哒唑(nocodazole)的后续处理,将HeLa细胞同步于有丝分裂的前中期.然后,用流式细胞仪检测细胞周期、Western印迹和免疫荧光法,观察γH2AX表达和γH2AX焦点的形成.结果显示,细胞进入G2/M期和有丝分裂过程中,γH2AX水平显著增加;在无DNA DSB发生的情况下,部分M期细胞中也存在大量的γH2AX焦点.随着细胞完成有丝分裂从M期退出再进入G1期,γH2AX的表达水平逐渐降低.这种γH2AX表达变化特征与G2/M期密切关联的PLK1和Cyclin B1的表达规律相类似.在4 Gy大剂量照射下,HeLa细胞于照后8到12 h出现明显的G2/M期阻滞.γH2AX焦点数在照后1 h达高峰,随后降低,照后8 h又上升,出现了第2个峰值.与之不同的是,在1 Gy低剂量照射下,细胞的G2/M期阻滞微弱,γH2AX焦点数在照后0.5 h最高,随后下降,且无反弹,符合DNA DSB的修复动力学特征.因此,将γH2AX当做DNA DSB分子标志物时,还需要考虑细胞周期变化的影响.γH2AX适合作为1 Gy以下照射的DNA双链断裂损伤的分子标志.

2-乙酰氨基芴诱导γH2AX焦点的形成

目的探讨DNA损伤剂2-乙酰氨基芴(2-AAF)是否可诱导γH2AX焦点的形成及γH2AX作为检测DNA损伤的一个新的特异指标的可能性。方法用2-AAF处理中国仓鼠CHL细胞,应用免疫荧光方法检测γH2AX焦点的形成,并通过中性彗星实验验证DNA损伤的程度。结果0.1,1,5和20mg·L-1的2-AAF都可使细胞核内γH2AX焦点数量及有γH2AX焦点生成的细胞数量增加,但只有20mg·L-12-AAF处理的细胞才出现明显的彗尾增长及有彗尾的细胞数量增加。另外,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族抑制物渥曼青霉素可抑制2-AAF诱导的γH2AX焦点形成。结论2-AAF可通过激活PI3K家族成员使H2AX磷酸化,进而诱导γH2AX焦点的形成。γH2AX检测DNA损伤的敏感性优于彗星实验,因此,γH2AX有可能成为衡量DNA损伤程度的良好指标。

冬凌草甲素诱导人胰腺癌SW1900细胞DNA损伤及对H2AX蛋白表达的影响

目的研究冬凌草甲素(ORI)诱导胰腺癌SW1900细胞DNA损伤对磷酸化组蛋白(H2AX)表达的影响。方法彗星实验检测ORI诱导胰腺癌SW1900细胞DNA损伤的程度。Western印迹检测不同浓度ORI作用胰腺癌SW1900细胞后H2AX蛋白的磷酸化。免疫荧光实验检测Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦点。结果彗星实验结果表明不同浓度的ORI(20,40,80μmol/L)处理SW1900细胞48 h后,可发生DNA损伤,并且随浓度增加,DNA损伤加重。Western印迹检测不同浓度ORI作用胰腺癌SW1900细胞后,H2AX蛋白发生磷酸化,γ-H2AX随着浓度增加表达增大。免疫荧光实验发现Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦点随着浓度增加表达量增加。结论 ORI可以诱导胰腺癌SW1900细胞DNA损伤;H2AX蛋白发生磷酸化,具体DNA损伤信号通路有待进一步研究。

γH2AX磷酸化/去磷酸化的分子机制及检测技术进展

自从γH2AX在1998年首次发现以来,迅速成为多个学科领域的研究热点和研究工具。针对γH2AX建立的多种先进检测方法在生命科学和医学等多个领域内的应用展现了发展潜力。本文从其磷酸化和去磷酸化机制,各种检测分析技术的发展和建立,以及在相关领域里的应用进展等三个方面进行了综述。

^(60)Co γ-射线诱导人膀胱癌EJ细胞中磷酸化组蛋白H2AX焦点形成

目的探讨60Co γ-射线是否可在人膀胱癌EJ细胞中诱导磷酸化组蛋白H2AX焦点形成以及形成的焦点数量与照射剂量及照射后时间的关系。方法免疫印迹法和流式细胞分析法用于检测不同剂量60Co γ-射线照射后EJ细胞中γH2AX蛋白表达的变化;免疫荧光法检测不同剂量照射后以及2 Gy照射后不同时间EJ细胞中γH2AX焦点的数量。结果γ-射线照射后γH2AX蛋白表达明显增加,但量效关系不明显;免疫荧光法可检测γH2AX焦点形成的数量和大小,并且存在剂量-效应关系及有时间依赖性,随着照射剂量的增加,γH2AX焦点数目及大小均明显增加,照射的剂量范围从0.1~4.0 Gy均可检测,照射后24 h仍可检测到γH2AX焦点,但焦点数随时间延长而减少、减弱。结论免疫荧光法检测照射后γH2AX焦点数目可敏感、直观地反映DNA损伤及修复情况,有望成为辐射检测及辐射致癌的好的生物指标。

应用γH2AX评估丝裂霉素致胃癌细胞DNA损伤

目的通过检测γH2AX,评估丝裂霉素对体外胃癌细胞DNA的损伤;同时,观察丝裂霉素对体外胃癌细胞增殖的影响。方法体外培养胃癌细胞株SGC-7901细胞,选用丝裂霉素处理,利用免疫荧光和Western-Blotting技术,分别检测γH2AX的焦点形成和蛋白水平变化;采用MTT法检测SGC-7901细胞的增殖情况。结果与对照组相比,实验组在每个时间点的γH2AX细胞百分数和平均焦点数都呈增加趋势,200μg/mL组和400μg/mL组的增加尤为明显,与对照组的差异有显著性(P<0.01)。用400μg/mL的丝裂霉素孵育SGC-7901细胞,γH2AX蛋白的水平变化呈先升后降趋势,差异有显著性(P<0.05)。MTT结果显示,丝裂霉素对SGC-7901细胞的增殖抑制明显(P<0.05)。结论γH2AX可敏感反应丝裂霉素对胃癌细胞DNA的损伤,潜在的临床应用价值极高;丝裂霉素对体外胃癌细胞增殖抑制明显。

γH2AX与男性不育患者精子DNA损伤的关系及意义

目的研究γH2AX在男性不育患者精液中的表达水平,探讨γH2AX用于评价男性不育患者精子DNA双链断裂(DSBs)损伤程度的可行性。方法选取就诊于广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心、男性科门诊并确诊为男性不育患者27例(男性不育组),另外选取23例确认有生育能力的健康男性的精液样本作为对照组。通过PureSperm密度梯度离心法(DGC)优选精子,运用单向凝胶电泳技术(SCGE)和流式细胞术方法对健康男性、男性不育组患者的精液进行精子双链DNA损伤和γH2AX含量的测定和比较。结果男性不育组患者精子DSBs损伤程度和γH2AX表达含量均高于对照组(P<0.01),而经密度梯度离心法优选精子后,两组男性精子的DSBs损伤程度和γH2AX表达含量均显著下降(P<0.01)。结论γH2AX在男性不育患者精子中的含量明显高于健康男性,可作为检测精子DNA双链断裂损伤程度的一个新的标志物。

不同方式加热联合甲基莲心碱对耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞γH2AX及mdr-1/P-gp表达的影响

目的:检测不同模式加热联合甲基莲心碱(neferine,Nef)对耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞的增殖抑制及γH2AX和mdr-1/P-gp表达的影响。方法:采用MTT法检测金属模块加热、培养基加热、烤箱加热及水浴加热等不同模式加热联合10μg/mL Nef对经阿霉素培养的MCF-7/Adr细胞的增殖抑制,实时定量PCR检测mdr-1mRNA的表达,Western印迹法检测γH2AX及P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达。结果:42℃及45℃不同模式加热组较37℃培养组MCF-7/Adr细胞吸光度值明显下降,mdr-1/P-gp表达下降,γH2AX表达上调(均P<0.01)。加热联合10μg/mLNef组较单纯热疗组及单纯10μg/mLNef组MCF-7/Adr细胞吸光度值明显下降(均P<0.01),mdr-1/P-gp表达下降,γH2AX表达上调(均P<0.05)。42℃及45℃不同模式加热组比较,水浴加热组P-gp表达下降及γH2AX表达上调最为明显(P<0.05)。结论:加热能增加阿霉素对MCF-7/Adr细胞的细胞毒性反应,能明显增加MCF-7/Adr细胞DNA损伤且随温度升高而加剧;MCF-7/Adr细胞对不同模式的加热反应可能不同;热疗联合Nef能增敏阿霉素的化学治疗效果。

基因组的监视器：组蛋白H2AX

组蛋白H2A变体H2AX在离其肽链C端4个氨基酸处存在一个高度保守的丝氨酸残基(Ser-139),DNA双链断裂(DSB)一经产生,该残基便能迅速被磷酸化,形成γ-H2AX。γ-H2AX识别抗体是探测DSB存在的金标准；H2AX在细胞周期关卡中起重要作用,H2AX(?)细胞不能正确停止在G2期并进入有丝分裂期；H2AX的丧失不影响V(D)J重排,但有效的类型转换重组需要H2AX；H2AX还在细胞分裂中起重要作用。总之,H2AX是基因组的监视器,DNA损伤一旦发生,H2AX的磷酸化即会被启动,然后招募更多的修复因子共同修复DNA损伤；H2AX在抑制基因组不稳定和癌症放疗疗效预测方面具有一定的作用。

γH2AX分析技术用于检测CT辐射剂量的初步研究

应用DNA双链断裂的生物标记物——γH2AX(H2AX组蛋白异型的磷酸化形式)的荧光显像即γH2AX分析技术,通过体外实验研究,了解CT辐射剂量与外周血单个核细胞(PBMCs)中产生的γH2AX荧光点数目的相关性,初步探讨其在检测CT辐射剂量方面的应用前景。观察结果表明,人外周血体外经CT扫描后DNA损伤诱发H2AX活化产生γH2AX,通过荧光显微镜检测到的γH2AX荧光点数目变化与CT扫描的照射剂量之间呈线性正相关,γH2AX分析具有直接作为检测CT辐射剂量的生物学标记的潜力。

DNA损伤修复过程中H2AX磷酸化的调控及其意义

组蛋白2A变异体(histone family 2A variant,H2AX)在DNA双链断裂(double-strand break,DSB)损伤时可以发生不同的翻译后修饰,包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。通过这些修饰,H2AX标记损伤的DNA双链,促进局部DNA修复因子和染色体重塑因子的募集,维持基因组的稳定性。这对于DSB的有效修复及细胞周期从周期检查点的恢复都是十分必要的。另外,H2AX在DSB信号通路必不可少的作用及其在肿瘤发生早期被激活事件,使它成为肿瘤生物学研究中的热点基因蛋白。本文中重点阐述近几年H2AX在DSB损伤修复中的研究进展,同时提出将它作为一个表观遗传标记,在人类肿瘤的早期诊断和治疗中的潜在应用价值。

钴-60伽玛射线诱导淋巴细胞γH2AX表达的研究

采用流式细胞术检测60Coγ-射线照射后γH2AX表达的量效和时程关系,同时探讨紫外线联合60Coγ-射线照射后γH2AX的表达情况。结果表明,不同剂量60Coγ-射线照射后γH2AX表达量与照射剂量之间呈现明显的剂量效应关系。4 Gy 60Coγ-射线照射后,γH2AX的表达在1 h达到峰值,随后逐渐减少。与假照组相比,单纯紫外线照射组γH2AX表达增加,一直稳定维持约6 h左右,随后开始减少。紫外线联合60Coγ-射线照射组与单纯60Coγ-射线照射比较,γH2AX的表达无显著性差异。结果提示采用流式细胞术检测γH2AX的表达估算受照剂量具有可行性,该法有望成为估算辐射剂量的新方法。

H2AX活化与DNA双链断裂及辐射剂量的关系

H2AX是组蛋白H2A的一种亚型。过去对组蛋白的关注仅局限在维持染色质结构的认识方面,近来发现构成染色质核小体的组蛋白同时具有许多其他重要生物学功能,在DNA双链断裂修复中的作用就是最重要的发现之一。H2AX蛋白发挥其功能需要活化,活化后的H2AX称为γH2AX。检测γH2AX可以确定DNA双链断裂的存在,γH2AX的检测量与辐射剂量也存在良好的量效关系。

循环肿瘤细胞γ-H2AX检测评估化疗疗效研究进展

作为目前肿瘤治疗主要手段之一的化疗应用广泛，对其疗效的评价依据基于影像学肿瘤缩小而设计的RECIST标准，一般在2～4个周期化疗后进行评估。姑且不论在影像学图像如CT片上进行测量，容易产生对可评价病灶数毫米级的测量出入，以及存在于测量者与测量者之间的差异；

重离子所致DNA双链断裂损伤修复的γH2AX焦点响应

DNA双链断裂(DSB)是电离辐射所致基因组DNA的主要和最严重的损伤类型,磷酸化组蛋白γH2AX能比较特异地在DSB处形成焦点,是DSB的分子标志物之一。比较了重离子~7Li、^(12)C与γ射线辐照小鼠MEF细胞诱发γH2AX焦点的规律特征。结果显示,诱发形成的平均每个细胞的γH2AX焦点数目与照后时间相关,表达峰值出现在照后2 h,但不同类型辐射高表达的持续时间不同。在相同剂量下,致焦点形成率与辐射的LET值相关,LET值越高,形成率越大。γ射线诱发的γH2AX焦点尺寸随照后时间无明显变化,高LET重离子诱发的γH2AX焦点尺寸随时间变化先增加后减小;与低LET的γ射线相比,高LET辐射诱发的焦点平均尺寸明显变大,LET越高焦点尺寸越大且保持时间越长。

γH2AX和ATM与内源性氧化剂所致DNA损伤关系的研究进展

本文综述了正常细胞及肿瘤细胞系中内源性氧化剂所致的磷酸化ATM(CAA)和γH2AX(CHP)的形成与表达;同时综述了各种影响因子和生长条件对CAA和CHP表达的影响。

γH2AX预测肺癌患者化疗敏感性的研究

目的:探讨应用磷酸化组蛋白(γH2AX)预测肺癌患者对顺铂、卡铂、吉西他滨、阿霉素等化疗药物敏感性的可行性和可靠性。方法:原代培养肺癌患者肿瘤细胞,分别予不同浓度的化疗药作用后,采用流式细胞术(FCM)、免疫细胞化学法(ICC)、MTT比色法,比较并分析各不同浓度药物作用下肿瘤细胞中γH2AX灶点数、γH2AX阳性细胞百分数及细胞增殖抑制率的差异。结果:在同种药物不同浓度作用下,肿瘤细胞内γH2AX灶点数、γH2AX阳性细胞百分数及细胞增殖抑制率之间的差异具有统计学意义(P均<0.05),并相互之间具有相关性(P均<0.05),不同药物之间γH2AX的表达差异有统计学意义(P均<0.05),并与细胞增殖抑制率间具有相关性(P均<0.05)。结论:肿瘤细胞内γH2AX的表达能在一定程度上预测其对化疗药物的敏感性并对指导肿瘤患者的个体化治疗有重要意义。

γH2AX分析技术研究应用进展

细胞在电离辐射及其他因素作用下,会发生DNA损伤断裂,γH2AX分析技术可清楚地知道DNA损伤断裂程度及修复情况,因此,γH2AX已成为目前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的热点之一.文章主要对γH2AX的研究应用进展作一综述.