磷酸转移酶系统影响细菌生物膜形成的研究进展

细菌生物膜(BF)是细菌在物体表面形成的一种复杂三维结构,具有高度耐药性和环境适应性。BF的形成是细菌适应环境和导致持续感染的重要方式,其存在严重威胁人类健康。细菌磷酸转移酶系统(PTS)作为细菌糖类摄取和代谢糖类的关键系统,在细菌代谢和信号传导中发挥至关重要的作用,其通过独特的磷酸化级联反应,从而精确调控糖类的运输和代谢,进而影响细菌的生理状态和行为模式。该文就PTS关键组分在不同细菌中对其BF影响的研究进展作一综述。

通心络对IL-1β介导的小型猪冠状动脉内膜增殖及5-HT诱发的冠状动脉痉挛的抑制作用

目的在体观察通心络抑制猪冠状动脉痉挛的作用及可能机制。方法选取16头小型雄性家猪,麻醉后进行左侧开胸手术,选择心脏左前降支及回旋支近端管腔外径大小近似的两处节段进行仔细分离,在血管外膜包裹吸附白细胞介素-1β(IL-1β,2.5μg)的纸巾,构建冠状动脉痉挛模型,2周后采用冠状动脉造影观察经导管冠脉内给予5-羟色胺(5-HT,10μg/kg)诱发冠状动脉痉挛情况。将成功诱发冠状动脉痉挛的12头小型猪随机分成两组,对照组6只(12个血管段),单纯喂养专用饲料;通心络组6只(12个血管段),喂养专用饲料和通心络〔1g/(kg.d)〕,连续喂养4周后停药1周,进行第2次造影并以同样方法进行诱发痉挛实验。造影结束后处死动物,截取包裹IL-1β的血管段,进行病理学检查,并采用RT-PCR方法测定各组手术处理血管段(Ras hom ologue,Rho)激酶mRNA表达,采用Western blot方法测定其底物肌球蛋白结合亚基磷酸化(myosin-binding subunit phosphorylation,MBS-P)的表达。结果冠状动脉造影显示,12头小型猪冠状动脉局部血管发生不同程度的管腔狭窄(20%～30%),5-HT能诱发其痉挛。第2次造影显示,对照组11血管段5-HT诱发痉挛阳性,1血管段5-HT诱发痉挛阴性。通心络组2血管段5-HT诱发痉挛阳性,10血管段5-HT诱发痉挛阴性。病理学检查,两组均可见不同程度的巨噬细胞聚集现象,通心络组与对照组比较管腔狭窄程度及内膜增殖明显减轻。对照组Rho激酶mRNA的表达及肌球蛋白磷酸酶(MLCP)的MBP-S水平明显上调,通心络组Rho激酶mRNA表达〔(71.5±2.4)%〕被抑制,与对照组〔(98.2±7.7)%〕比较差异有统计学意义(P<0.05),通心络组MBS-P的灰度值(16633±1390)明显降低,与对照组(25818±4745)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通心络具有明显抑制IL-1β介导的冠状动脉内膜增殖及5-HT诱发的冠状动脉痉挛的作用;抑制IL-1β包裹血管段细胞内Rho激酶mRNA表达,减少MBS-P表达可能是其作用机制之一。

转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究

研究了转基因及常规水稻幼苗叶面喷施潮霉素B溶液后的反应。结果发现,常规水稻吸收潮霉素B后,叶片会出现以褐斑为特征的中毒症状。在50～100mgL浓度范围内,褐斑的数目和面积随时间和浓度的增加而增加,溶液中滴加DMSO可提高潮霉素对稻苗的毒性。浓度在75mgL及以上时,喷后第7天,处理的所有幼苗都出现症状。而浓度在50mgL时,个别幼苗经处理后未出现中毒症状。在上述浓度范围内,带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的Bt转基因水稻(克螟稻)幼苗均未出现中毒症状。苗期鉴定与抽穗前后成株期鉴定的结果相一致。讨论了叶面喷施潮霉素B溶液在转基因水稻育种和筛选潮霉素敏感转基因水稻突变体中的可能应用。

水稻穗期活体植株对潮霉素的敏感性分析及突变体选育

携带潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)的转基因作物细胞和组织对抗生素潮霉素具有一定耐性,是作物尤其是单子叶作物遗传转化中常用的选择基因。本研究旨在建立一种活体植株潮霉素抗性快速鉴别技术,用于转基因育种和相关研究。在始穗期前后,用不同浓度潮霉素B溶液(25～100mg/L)喷洒常规及转基因水稻植株,考察叶片和谷粒的中毒症状。发现常规水稻在高于50mg/L的潮霉素溶液处理后,叶片出现褐色斑点,稻穗部分谷粒颖壳呈黄褐色的中毒症状,叶片斑点和黄褐色谷粒的数量均随剂量增大而增加。经100mg/L潮霉素处理后,籼稻品种嘉优99和C10剑叶每平方厘米平均斑点数目为21.1和19.2个,穗上黄褐色谷粒比例分别达27.6%和23.5%;粳稻品种嘉优5号和R5叶片中毒斑点数为11.8和10.7个,黄褐色谷粒比例分别为11.2%和11.9%,表明2份籼稻材料较2份粳稻材料对潮霉素更为敏感。在上述浓度范围内,携带HPT的转Bt基因水稻克螟稻1号均未出现中毒症状。对γ射线诱变处理克暝稻的M2群体(共12万株)穗期喷施100mg/L的潮霉素B溶液,从中筛选到42株潮霉素敏感型突变体,组织化学法分析表明这些植株具有β-葡萄糖苷酸酶GUS活性。对能够取到较嫩叶片的14个单株采用离体叶片法进行抗虫性鉴定,证明这些植株对二化螟仍然表现高抗。上述结果表明,在始穗期喷施100mg/L潮霉素溶液,潮霉素敏感植株可出现明显、直观的中毒症状,可以在活体植株水平上有效鉴别植株是否携带HPT,可用于育种中转基因植株的筛选或转基因安全评估中植株的鉴别。

基因枪法转基因水稻中hpt基因稳定遗传

基因枪转化将潮霉素磷酸转移酶基因（ｈｐｔ）导入粳稻品种７７１７０，获得可育的转基因植 株，研究外源基因遗传的稳定性。自交后代（Ｔ１和Ｔ２）经潮霉素筛选获得抗性植株和敏感植 株，分子鉴定结果表明抗性植株带有ｈｐｔ基因，而敏感植株中没有ｈｐｔ基因存在。Ｔ１和Ｔ２代中 潮霉素抗性表现为显性单基因位点的遗传方式，符合孟德尔分离规律，并得到分子鉴定结果 的证实。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示，ｈｐｔ基因多拷贝整合在水稻基因组中，并成紧密连锁状态在 Ｔ１和Ｔ２代中稳定遗传。ＳＧ－１５的部分Ｔ２代株系中发现ｈｐｔ基因不完全失活现象，并且与甲基 化状态可能无关。

链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素3'-磷酸化酶抑制剂

氨基糖苷类抗生素3＇-磷酸化酶(APH3＇)抑制剂的产生菌广泛存在于各种类群的链霉菌中。本文报道作者用特定的方法筛到的APH3＇抑制剂都是多肽类物质,能用(NH_4)_2SO_4、丙酮沉淀法分离。粗制品较稳定,具有强的抑制APH3＇能力,能防止核糖霉素、新霉素、卡那霉素等不受钝化。较纯的抑制剂却很不稳定,纯化尚有困难。

一种新的卡那霉素残留检测方法

氨基糖苷 3′- O磷酰基转移酶Ⅱa (APH( 3′) -Ⅱa)具有磷酸化卡那霉素的功能 ,通过突变使APH( 3′) Ⅱa的催化活性丧失 ,同时保留与底物卡那霉素结合的功能 ,由此获得的突变型APH( 3′) - Ⅱa具有类似于抗体的特异性结合与识别卡那霉素分子的作用。采用戊二醛交联二步法制备了卡那霉素 辣根过氧化物酶结合物 (Kan HRP) ,把纯化后的APH( 3′) - Ⅱa蛋白包被到 96孔聚苯乙烯板上 ,通过竞争性ELISA的方法建立了一种新的卡那霉素残留检测方法。通过该方法可以检测到卡那霉素的最低残留量为 1 μg ml。

p38 MAPK在内毒素休克小鼠肺组织诱导型一氧化氮合酶表达中的作用

目的 观察脂多糖 (LPS)诱导的小鼠肺组织诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)表达的变化趋势 ,探讨p38丝裂原激活的蛋白激酶 (p38MAPK)在内毒素休克发生中的作用。方法 复制小鼠内毒素休克动物模型 ,分别观察LPS作用和组织中iNOS表达的时间过程、剂量 效应关系及 p38MAPK在其中的作用。动物在LPS处理后 ,收集血液 ,用Griess法检测血浆一氧化氮 (NO)水平 ;取肺、肝、肾等组织样本 ,分别用Western印迹法和RT PCR检测组织iNOS蛋白和mRNA表达 ,用免疫沉淀和放射自显影检测组织p38MAPK活性。结果 ①腹腔注射LPS后可引起双峰型进行性的动脉血压下降 ,6h后达到重度休克 ;②iNOS在正常肺中就有少量表达 ,注射内毒素后肺组织iNOSmRNA和蛋白表达增加 ,血浆中NO水平升高 ,它们与LPS存在剂量 效应关系 ,并且在一定的时间范围内 ,随着LPS作用时间的增加iNOS表达也增高 ;③注射LPS后 ,在心、肝、脾、肺、肾、肠等组织中 ,肺iNOS表达最早 ,水平最高 ;④LPS注射的小鼠iNOS表达增高的同时 ,肺中 p38MAPK信号转导通路被激活 ;用p38MAPK特异性抑制剂SB 2 0 3580后 ,可以显著降低血浆NO水平及肺组织中iNOSmRNA和蛋白的表达 ,但对血压下降并无显著性影响。结论 在正常情况下 ,小鼠肺组织有少量iNOS表达 ,内毒素休克时全身多种器?

新霉素磷酸转移酶基因npt Ⅱ的原核表达、蛋白纯化及其活性鉴定

通过PCR方法从pCAMBIA1305载体上克隆了新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的全编码序列,并插入到原核表达载体pET30a(+)中,构建了重组质粒pET30a-nptⅡ。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,获得了相对分子量为35kD的表达蛋白,约占全菌总蛋白的45%。表达蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。用5mmol/L二硫苏糖醇和1%十二烷基肌氨酸钠变性溶解包涵体,经透析后复性获得了可溶性重组蛋白。将可溶的表达蛋白用Ni 2+-NTA亲和层析纯化,获得纯化的NPTⅡ蛋白,电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度达95%以上。体外活性检测显示,NPTⅡ蛋白具有良好的生物活性,在浓度30μg/mL以上时可使卡拉霉素失去抑菌活性。

HSV-tk/GCV协同放射治疗黑色素瘤的实验研究

目的：了解ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统协同放射治疗对小鼠黑色素瘤的联合杀伤作用。方法：通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和ＨＳＶ－ｔｋ的融合基因（ｈｙｔｋ）导入黑色素瘤细胞中并获得表达，通过体外和Ｃ５７ＢＬ／６小鼠动物实验，检测 ＧＣＶ对转基因细胞的体内外杀伤作用及联合应用放射治疗对黑色素瘤的治疗作用。结果：ＰＣＲ、ＲＮＡ Ｄｏｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ、免疫组化检测证实ＨｙＴＫ在转基因细胞的表达，体内外实验示ＧＣＶ对Ｂ１６／ＨｙＴＫ细胞有明显的杀伤作用，而对野生型Ｂ１６细胞无明显杀伤作用（Ｐ＜０．０５）；联合应用低剂量ＧＣＶ可使转入ｈｙｔｋ基因的黑色素瘤细胞对放疗的敏感性明显增高（ＳＥＲ＝１．６２），体内实验也证实协同疗法可延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系统协同放射治疗有望成为黑色素瘤基因治疗的一种有效方法。

EML4-ALK在非小细胞肺癌中的表达及其临床病理特征

目的探讨免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)在检测非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者棘皮动物微管相关蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4 gene,EML4)和间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase gene,ALK)融合蛋白的表达情况及其临床病理特征。方法收集NSCLC组织标本384例,其中手术标本245例,穿刺标本139例,采用IHC法检测组织中的EML4-ALK融合蛋白。结果 EML4-ALK融合蛋白在手术标本和穿刺标本中的阳性率分别为9.0%和12.2%(P>0.05)。EML4-ALK融合蛋白在NSCLC患者腺癌中的阳性率为13.0%,高于其他类型的阳性率(0.0%),差异具有统计学意义(P<0.01);Ⅲ~Ⅳ期NSCLC患者的阳性率高于Ⅰ~Ⅱ期(18.0%vs 6.5%,P<0.05)。在NSCLC腺癌患者中,EML4-ALK融合蛋白阳性率在性别、年龄、吸烟史、分化程度、临床分期和淋巴结转移方面比较,差异均具有统计学意义(均P<0.05),而在腺癌的组织类型和肿瘤大小方面比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论 IHC法检测EML4-ALK融合蛋白可用于NSCLC患者的诊断和筛查,EML4-ALK融合蛋白在NSCLC尤其NSCLC腺癌中具有独特的临床表现和病理特征。

抗HPT单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定

目的 :制备抗潮霉素B磷酸转移酶 (HPT)的单克隆抗体 (McAb) ,建立一种快速检测转基因作物中该选择标记基因HPT编码蛋白的方法。方法 :用基因重组潮霉素B磷酸转移酶 (HPT)抗原免疫BALB C小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb。选择不同的抗原决定簇与兔抗HPT多抗配对 ,建立双抗夹心ELISA检测HPT抗原。结果 :筛选出四株稳定分泌抗HPT单抗的杂交瘤细胞株 ,IgG亚类鉴定均为IgG1,ELISA检测证实单抗可特异性识别细胞培养上清、重组子菌体裂解产物中及纯化出的HPT蛋白。结合位点测定实验表明 4株单抗是针对不同的抗原决定簇 ,与多克隆抗体组成双抗夹心ELISA法 ,均可较好地检测到HPT抗原。检测的灵敏度为 30ng ml,且与别的无关抗原无交叉反应性。结论 :4株杂交瘤细胞株特异性好 ,亲和力强 ,组成双抗夹心ELISA法可用于快速。

根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化

以玫瑰茄无菌苗的子叶和下胚轴为受体材料,农杆菌LBA4404和EHA105为供体菌株,对玫瑰茄细胞外植体遗传转化的基本条件进行研究,建立了一个高效的玫瑰茄细胞遗传转化体系.利用这一转化体系获得了2个稳定表达新霉素磷酸转移酶活性的玫瑰茄转化细胞系.β-葡萄糖苷酸酶活性的组织化学检测和PCR扩增鉴定的结果表明,外植体总转化率达29.4%.试验结果还显示农杆菌LBA4404菌株较适合玫瑰茄外植体的转化,转化时不需添加乙酰丁香酮.

转多基因杨树中抗生素标记基因NPTⅡ表达量分析研究

对转基因库安托杨及银腺杂种杨（含1-5个外源基因）中选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）进行PCR扩增,证实该基因稳定存在于转基因杨树的基因组中。应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）对2种转基因杨树中NPTII蛋白的表达量进行定量检测,结果显示：NPTII蛋白的表达量并没有随着目的基因数量的增加而升高,说明与转单个基因杨树相比,转多个基因杨树可能由标记基因引起的生物安全问题并不会加剧。

分泌蛋白特异性基因陷阱的设计与验证

蛋白质分子向细胞外分泌的过程有赖于信号肽的介导 .基因陷阱是功能性基因克隆的一种有效方法 ,经典的基因陷阱以geo作为报告基因 ,对所克隆的基因类型没有选择性 .将绿脓杆菌外毒素、 2A序列、IL 2受体穿膜区以及新霉素磷酸转移酶的基因依次融合构建新型报告基因——— peo ,该报告基因能够特异性地甄别具有信号肽编码序列的基因 .为验证 peo对信号肽编码序列的特异性甄别作用 ,以 peo为报告基因 ,构建了 3种质粒载体 ,分别模拟用基因陷阱载体进行筛选时可能出现的 3种情况 ,通过转染HeLa细胞、G4 18筛选以及碱性磷酸酶检测 ,证明 peo能够有效地区分信号肽和非信号肽编码序列 ,以 peo为报告基因改造的基因陷阱载体可以用于分泌蛋白基因的筛选 .

hprK基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响

枯草芽孢杆菌在葡萄糖丰富的环境中,胞内糖分解代谢物浓度的提高将引起碳分解代谢物阻遏效应(CCR)及糖吸收的抑制,对核黄素等发酵过程产生不利影响。通过缺陷细胞的分解代谢物控制蛋白A(CcpA)可以解除CCR效应,但不能解除糖吸收的抑制。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)是枯草芽孢杆菌主要的糖吸收方式,HPr蛋白和双功能的HPr激酶/HPr-Ser46-P磷酸酶(HprK/P)参与PTS系统的调控。在葡萄糖丰富的条件下,HprK/P的激酶活性受1,6-二磷酸果糖激活,催化HPr蛋白46位丝氨酸残基磷酸化,形成HPr-Ser46-P。HPr-Ser46-P抑制某些碳源透过酶基因的表达;同时HPr-Ser46-P难以被酶Ⅰ在His15磷酸化,不能在PTS系统中发挥转移磷酸基团的作用,使细胞的糖吸收受到抑制。在CcpA缺陷的背景下,敲除核黄素生产菌株B.subtilis24A1/pMX45的HprK/P编码基因hprK,构建了CcpA和HprK/P双缺陷的重组菌B.subtilisZHc/pMX45。摇瓶发酵显示,B.subtilisZHc/pMX45核黄素发酵的最适葡萄糖浓度由24A1/pMX45的8%提高到10%;核黄素产量达到4.374mg/mL,比24A1/pMX45提高了19.2%。结果表明,CcpA和HprK/P的双缺陷可有效解除高浓度葡萄糖所引起的CCR效应和糖吸收抑制,有助于提高细胞对葡萄糖的耐受力,并提高核黄素产量。

解淀粉芽孢杆菌ptsGHI基因的敲除及缺陷株生长特性

在解淀粉芽孢杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要是由ptsGHI操纵子编码的酶EI、HPr、EIIGlc转运入细胞.文中运用PCR技术,扩增出ptsG和ptsHI基因上下游的DNA片段,共约1kbp,用融合PCR连接上下游片段后,再连接到温敏型质粒pKS2上,然后电转化到解淀粉芽孢杆菌XH7中,最终构建了ptsG和ptsHI基因缺陷株.实验结果显示:在LB培养基中,ptsG及ptsHI基因缺陷株的生长状况与野生型菌株无明显差异;在含葡萄糖的LB培养基中,ptsG基因缺陷株的最高菌密度比野生型菌株提高了28%,且平稳期比野生型菌株要长,而ptsHI基因缺陷株的最高菌密度比野生型菌株降低了约32%,与其在LB中的生长状况基本一致;ptsG和ptsHI缺陷株及野生型菌株经鸟苷发酵实验后,ptsG基因缺陷株的鸟苷产量比野生型菌株提高了约24%,ptsHI基因缺陷株的鸟苷产量则比野生型菌株降低了约82%.以上结果表明:解淀粉芽孢杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和产物合成能力.

绿色荧光蛋白和潮霉素抗性双标记载体转化草酸青霉菌P8的研究

草酸青霉菌P8(Penicillium oxalicum)溶磷菌株具有较强的溶解多种无机难溶磷的能力和促进作物生长的作用。为研究P8在作物根际的定殖状况,用携带加强型绿色荧光蛋白和潮霉素抗性的双标记载体转化溶磷青霉菌P8的原生质体,筛选出稳定、高效表达GFP并对潮霉素产生抗性的转化菌株,Southern杂交分析结果显示,外源质粒DNA是以非同源重组方式整合到转化菌株基因组染色体上。试验证明转化菌株的形态学特征和溶磷能力与野生型菌株无明显差别。

重组大肠杆菌生产核苷磷酸转移酶的发酵条件优化

核苷磷酸转移酶能够特异地将无机焦磷酸(PPi)的磷酸根转移到核苷5′-位的羟基上,该过程并不需要ATP的参与,且具有选择性高和反应条件温和等特点。以实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT为菌株,进行了5 L发酵罐中的培养条件优化,确定了以乳糖作为诱导剂时,最佳诱导时机OD600为7左右,诱导剂乳糖的浓度为10 g/L;确定了最适通气量为1.5 L/min。在该条件下,核苷磷酸转移酶酶活达221.4 U/L,OD600为20.4。

P85磷酯肌醇-3激酶-蛋白激酶C-ζ复合物对血管紧张素Ⅱ激活平滑肌细胞p70核蛋白体S6激酶的调节作用

作者以前的研究发现蛋白激酶C ζ介导血管紧张素Ⅱ经Ras MEK途径激活血管平滑肌细胞丝裂素活化的蛋白激酶MAPK或细胞外信号调节激酶ERK1/ 2。本文研究了P85磷酯肌醇 3激酶 蛋白激酶C ζ复合物核蛋白体激酶p70S6激酶活性的调节作用及其信号传递途径。WesternBlot分析显示正常培养的血管平滑肌细胞表达p70S6激酶、p85磷酯肌醇 3激酶和蛋白激酶C ζ。 10 0nmol血管紧张素Ⅱ和 10 μg/L血小板源生长因子刺激并不影响p70S6激酶、p85磷酯肌醇 3激酶和蛋白激酶C ζ表达。p70S6激酶磷酸转移酶活性分析发现血管紧张素Ⅱ与血管平滑肌细胞作用 5min即开始激活p70S6激酶 ,2 0min达高峰 ,并呈剂量依赖性。磷酯肌醇 3激酶抑制剂wort mannin (10nmol)、蛋白激酶C ζ抑制剂PseudoZ (5 0 μmol)和p70S6激酶抑制剂rapamycin (10 0 μg/L)均可明显阻断血管紧张素Ⅱ诱导的p70S6激酶激活。有趣的是 ,我们观察到p85磷酯肌醇 3激酶和蛋白激酶C ζ受血管紧张素Ⅱ和血小板源生长因子刺激后均向Ras转位并与之结合 ,抗Ras抗体可将p85磷酯肌醇 3激酶或蛋白激酶C ζ混合沉淀 ,抗p85磷酯肌醇 3激酶抗体亦可使蛋白激酶C ζ沉淀下来。提示Ras、p85磷酯肌醇 3激酶和蛋白激酶C ζ三种蛋白结合在一起形成一个功能复合体 。