核酸荧光探针检测在临床疾病分子诊断中的应用

核酸荧光探针检测正逐渐成为临床疾病分子诊断的重要手段。这项技术主要应用具有高度特异性的荧光探针靶向疾病相关核酸序列,从而实现对目标核酸的高灵敏度、高特异性检测。核酸荧光探针检测在临床中的应用十分广泛,包括感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤的诊断。而随着纳米技术的不断发展,具有更高检验效能的核酸荧光探针检测体系也不断产生。其中基于荧光淬灭纳米材料构建的均相核酸检测体系由于其较高的检测能力和简单的体系,将有助于进一步推动疾病分子诊断的发展。该文主要述评了核酸荧光探针检测在多种疾病诊断中的临床应用,并讨论了利用荧光淬灭纳米材料构建的均相核酸检测新体系的原理和应用价值。

用光生物素核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒

用光生物素标记牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitisvirus,IBRV)9.6kb DNA片段做探针,可检测出10pg的IBRV DNA、1个TCID50的病毒和1～10个TCID50的实验感染牛精液。用核酸探针检测IBRV与分离病毒的符合率为84.4％。若将采集的样品在牛肾细胞上增毒一次,再抽提培养物的核酸,用核酸探针检测,则敏感性和符合率大为提高。

鸡传染性支气管炎病毒地高辛标记探针检测方法的的建立和应用

根据GenBank中已经发表的IBV N基因的保守序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR技术扩增IBVN基因的582 bp的核酸片段,并制备出地高辛标记的IBV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与不同毒株的IBV核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、鹅副粘病毒的核酸杂交反应为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对IBV的最低检出量为10 pg,显示所制备的核酸探针用于IBV的检测是可行的。

应用DIG标记探针杂交检测IBDV

本试验用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，ＤＩＧ）标记的探针建立了核酸杂交检测传染性法氏囊病病毒（ＩＢ－ＤＶ）的方法，并在敏感性方面同琼脂扩散试验进行了比较。探针来源于ＩＢＤＶＳＴＣ－ｌｌ９和ＳＴＣ－２４３ｃＤＮＡ。杂交方法的敏感性试验表明，核酸杂交可以检测到０．１ｐｇ的ＩＢＤＶＲＮＡ；与多个毒株核酸的杂交则显示出标记的探针可以作为通用试剂用于ＩＢＤＶ早期感染的诊断；而同琼脂扩散试验的比较则说明，杂交方法比常规的免疫沉淀反应敏感１０４倍以上。除此之外，由于杂交方法特异以及非放射性探针操作方便，因而具有很大的应用前景。

光敏生物素标记核酸探针检测A群轮状病毒的研究

采用光敏生物素标记Ａ群轮状病毒（ＧＡＲＶ）全基因组ＲＮＡ，制备了ＧＡＲＶ群特异核酸探针，该探针与样品进行打点杂交，经亲和素－碱性磷酸酶（ＡＶ－ＡＰ）系统显色，可检出１００ｐｇ病毒ＲＮＡ序列。试验表明轮状病毒光敏生物素核酸探针具有特异、灵敏、稳定的特点，可用于ＧＡＲＶ的检测和进行基因相关性研究。

禽传染性喉气管炎病毒TK基因狄高辛探针的研制及应用

应用狄高辛标记禽传染性喉气管炎病毒（ＡＩＬＴＶ）ＴＫ基因制备探针，经斑点杂交显色后，探针同以ＡＩＬＴＶ北京株为模板的ＴＫ基因ＰＣＲ产物及北京株核酸均呈阳性紫色斑点，而与正常尿囊液、新城疫病毒和火鸡疱疹病毒、禽传染性支气管炎病毒无反应，２株确诊为ＡＩＬＴＶ的野外分离毒也呈阳性。本研究结果表明，该ＴＫ基因探针是敏感和特异的，可用于禽传染性喉气管炎和其它呼吸道疾病的鉴别诊断。

光敏生物素标记犬细小病毒核酸探针的制备及其应用

将含有犬细小病毒2.0 kb DNA 克隆片段的重组质粒 pBI-264转化大肠杆菌 JF-803,扩增后用碱裂解法提取重组质粒,纯化后电泳,用冷榨法回收克隆片段。用光敏生物素分别标记重组质粒及克隆片段,制成重组质粒探针及克隆片段探针两种核酸探针,它们对犬细小病毒有相同的杂交特异性,检测灵敏度达 pg 水平,保存期至少8个月。检测25份犬粪样,阳性率为32%(8/25),而 HA-HI 试验为24%(6/25),两种方法的符合率为92%(23/25)。本试验从粪样直接提取病毒 DNA,用非放射性的光敏生物素标记探针检测,方法简便,可直接应用于兽医病毒学诊断。

用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒cDNA探针及其应用的研究

应用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒ｃＤＮＡ，制备核酸探针、经斑点杂交法和碱性磷酸酶显色后，探针同以ｃＤＮＡ为模板合成的ＰＣＲ产物及其重组子ｐＳＸＩＢＶＳ１均呈现强阳性的蓝色斑点，而与正常尿囊液、新城疫病毒和鸡败血霉形体无杂交。一个初诊为ＩＢ感染的田间病料与探针杂交阳性结果相符合。试验表明该ｃＤＮＡ探针是敏感和特异的检测方法。

普氏立克次体14KD蛋白基因DNA、生物素探针的制备及其应用的研究

我们用长臂光敏生物素标记了克隆的普氏立克次体Brein 1株的14KD蛋白基因DNA,并对此DNA探针的应用价值进行了研究。此DNA探针能与普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)和莫氏立克次体(Rickettsia mooseri)的DNA杂交而不能与斑点热群立克次体(Spotted Fever Group Rickettsiae)和大肠杆菌的DNA杂交。此生物素探针能检测出1ng的普氏立克次体DNA,并能检测出人工感染豚鼠的早期血液中的普氏立克次体和莫氏立克次体。

光敏生物素标记鸭瘟病毒核酸探针的制备及应用的研究

本试验研制了光敏生物素标记鸭瘟病毒全基因组核酸探针,对此探针的敏感性和特异性进行了研究。把提纯的鸭瘟病毒经蛋白酶消化后,提取核酸,核酸和光敏生物素经光标记后制成核酸探针。经亲和素—辣根过氧化物酶(AV-HRP)或碱性磷酸酶显色的核酸斑点杂交结果表明:该探针最低可检出10 pg(AV—AP法)同源的鸭瘟病毒F_(33)—DNA或10^(-5)稀释的攻毒鸭脑中的F_(33)—DNA;用辣根酶系统显色,灵敏度要比碱性磷酸酶的低约10倍;该探针与鸭瘟弱毒、禽巴氏杆菌、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病毒和正常鸭组织均不出现杂交信号,表明探针是敏感与特异的;探针在—18℃的保存期大于4个月;用探针检测21份病料,阳性率为90.5%(19/21),其中攻毒病料100%(7/7)被检出,而病毒分离—电镜法的检出率仅为75%(6/9)。杂交结果还显示了病鸭体内各组织含毒量的大小,依次是:脑>肝,脾>血,肾>肌肉。

肉食兽细小病毒核酸探针的制备及其初步应用研究

将提纯的貂肠炎病毒(MEV)中间复制型DNA(RF-DNA),以HinaⅡ酶切,回收0.7kbC片段并克隆至质粒pBR322中,构成重组质粒pBM,经转化大肠杆菌RRⅠ并扩增后,提纯pBM,酶切电泳回收克隆的C片段,以[α-32P]dATP标记C片段和pBM,用光生物素标记pBM,分别制成放射性同位素和光生物素核酸探针。采用打点杂交技术检测了5种肉食兽细小病毒的细胞培养物和非细小病毒科5种病毒的细胞培养物,同时检测了貂和犬的粪便样品33份。结果表明,32P标记的C片段和pBM探针与光生物素际记的pBM探针均具有相同的杂交特异性,与5种肉食兽细小病毒及感染细小病毒的貂、犬粪样呈杂交阳性反应,与其他科病毒及健貂、犬粪样呈阴性。同位素32P和光生物素标记探针分别检出1 pg和10 pg貂肠炎病毒RF-DNA,敏感性比血凝试验分别离100倍和10倍。