易错PCR技术提高黑曲霉N25植酸酶活力的研究

利用易错PCR技术对黑曲霉(Aspergillus niger)N25的植酸酶基因phyA进行定向进化研究,突变基因产物重组于表达载体pET32a(+)中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库,经筛选获得了最佳突变菌株pET32a-phyAep,其植酸酶活力比出发酶提高了41.8%。突变酶的酶学性质研究发现,与野生酶相比,它的热稳定性,最适温度和最适pH值无显著变化。

β-琼胶酶AgaB催化活性的定向进化

用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶 AgaB 热稳定突变酶 M446的催化活性。采用易错 PCR 和化学诱变法相结合的方法,构建了 M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系。最终筛选得到酶活性得到提高且保持较高耐热性的突变酶 M117,其酶活提高为突变酶 M446的3倍。测序分析发现编码突变酶 M117的 DNA 序列中有4处点突变,其中2处为同义突变,另外2处引发氨基酸替换,分别为 R9K 和 I111V。对突变酶 M117与 M446的动力学常数进行了比较,发现 M117的 Km 值降低了93.4%,Kcat/Km 值提高了15倍,由此可以推断突变酶M117比活力提高的主要原因是酶与底物的亲和能力提高。