三七疫病病菌Phytophthora cactorum生物学特性初步研究

通过对来自不同海拔地区的6个恶疫霉菌株的生物学特性测定，结果表明：该菌在CA（胡萝卜琼脂）培养基、燕麦培养基、CMA（玉米）培养基和三七汁培养基中生长速度较快；最适宜的碳源为甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖和D-甘露糖；最适宜的氮源为KNO3、脲和NH4NO3。其营养生长的温度范围是5—32℃，最适生长温度为24—26℃。不同地区菌株生长的最适温度有一定差异；该菌在pH值为3—12均能生长，最适pH值为5—8。土壤漫出液是诱导孢子囊产生的最好介质。

草果疫病初步研究

从发病的草果茎杆上组织分离得到草果疫病病菌,用不同农药进行药剂筛选试验,经哈茨木霉(Trichoderma harzimum)不同菌株和病菌在PDA平板上对峙培养,结果表明:易保1000倍药液下病菌菌丝无法生长,百菌清600倍、易保1500倍、春雷霉素400倍药液对病原菌菌丝生长抑制率在60%以上;哈茨木霉不同菌株对草果疫病病原菌有很好的抑制力,且药物诱变和紫外线诱变的突变菌株抑菌效果比野生型菌株好。

核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究

以2个雄器大多围生、少数侧生的苎麻疫霉菌株与1个雄器侧生、偶有围生的恶疫霉菌株为材料，采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物，PCR扩增3个供试菌株核糖体基因的ITS1和ITS2，并对PCR产物进行了克隆和序列分析。结果是苎麻疫霉的ITS1和ITS2分别由206和453个碱基组成， 而恶疫霉则分别由218和415个碱基组成。2个供试苎麻疫霉菌株的ITS1和ITS2的碱基序列同源性均分别为100%。苎麻疫霉和恶疫霉ITS1同源性为74.9%，其中中间区域40bp-164bp之间在两种间变异丰富，同源性只有59.4%，而1bp-39bp和165bp-239bp两区域的同源性分别为92.3%和92.1%; ITS2在两种疫霉菌间的同源性为71.0%。结果表明苎麻疫霉和恶疫霉ITS的碱基序列有明显差异。上述结果提示，ITS区域碱基序列可区分苎麻疫霉和恶疫霉。

8种植物挥发物和浸提液对三七根腐病菌的抑制活性研究

筛选挥发物及浸提液具有抑菌活性的作物,用于与三七轮作防治根腐病。采用菌丝生长速率法测定了8种植物的挥发物和浸提液对引起三七根腐病的恶疫霉菌和腐皮镰孢菌的抑制活性。葱属作物大蒜、洋葱、葱及韭菜的挥发物和浸提液对恶疫霉菌和腐皮镰孢菌均具有明显的抑制效果,且大蒜挥发物和浸提液的抑菌活性最强;生姜、鱼腥草、香菜茎和薄荷的挥发物抑菌效果不明显,甚至在低浓度下出现促进菌丝生长的现象,而生姜、香菜根和叶的浸提液则表现出明显的抑菌活性。本研究结果可为利用作物轮作控制三七根腐病提供科学依据,有利于实现三七根腐病的生态防控。

恶疫霉侵染的草莓SSH文库的构建及分析

为了解草莓与恶疫霉[Phytophthora cactorum(Lebert&Cohn)J.Schrt]互作的分子机制,以感病草莓品种FDP821为材料,以接种恶疫霉的草莓冠部为处理、未接种健康生长的草莓冠部为对照,利用抑制性差减杂交技术构建恶疫霉侵染诱导的草莓差异表达的cDNA差减文库。PCR鉴定随机挑取的阳性克隆,显示插入片段大小为300～1 000bp。随机挑取109个克隆进行测序,获得92个草莓EST,分析表明来自50个草莓基因。BLASTX比对结果表明:这些草莓基因的功能涉及抗病防卫机制、抗氧化作用、物质代谢和蛋白质合成等。这为理解草莓冠腐病抗性分子机制奠定了重要的数据基础。

恶疫霉实时定量RT-PCR分析中内参基因的选择

为选择合适的内参基因用于分析植物病原卵菌恶疫霉(Phytophthora cactorum)的基因表达情况,本研究利用实时定量RT-PCR分析持家基因Ubc、Tub-b、WS21和WS41在恶疫霉生长发育阶段和侵染草莓阶段的表达差异,并利用软件geNorm、NormFinder和BestKeeper比较其表达稳定性。结果表明:基于公共数据库序列和其他疫霉菌同源序列设计的持家基因引物在恶疫霉中具有良好的扩增效率、反应有效性和特异性。通过分析,发现在恶疫霉的不同生长发育阶段(菌丝生长、游动孢子囊、游动孢子和休止孢萌发)和侵染草莓阶段(接种后3、5、7天),表现最为稳定的是Ubc基因。当使用多个内参基因时,Ubc和WS41是最适合校正恶疫霉基因表达数据的内参基因组合。本研究结果为利用实时定量RT-PCR准确分析恶疫霉基因相对表达量提供了重要的内参基因,也为其他疫霉菌的基因表达研究提供了有价值的参考。

恶疫霉有性杂交后代的生物学研究

将 2个带有不同抗药性标记的恶疫霉菌株配对 ,培养 36 d后诱导其卵孢子萌发 ,从 376 0个单卵孢株中 ,获得 50株带有双亲标记的杂交个体。对其中 32株杂交个体的生长速率、有性和无性繁殖能力、卵孢子和游动孢子萌发率、致病力及对高温的耐受力等生物学性状进行测定。结果显示 ,测试的 32株杂交个体在 L BA培养基上均能较好地生长 ,有 2 4株的杂交个体的生长速率介于 2亲本之间 ;在 L BA和 SL培养基上 ,大多数杂交个体均能产生较大数量的卵孢子 ,有 37%的杂交个体在 SL培养基上产卵孢子能力显著大于双亲 ,仅有 1个杂交个体不产生卵孢子 ;在人工培养条件下 ,大多数供试杂交个体可以产生较大数量的孢子囊 ,其中 15株杂交个体产孢子囊能力处于双亲之间 ;被测的杂交个体产生的卵孢子或游动孢子均可以萌发形成有效的单孢株 ,有 2 2株的杂交个体的卵孢子萌发率大于 50 % ;被测的杂交个体接种在苹果上都有较强的致病力 ,有 16株杂交个体的致病力显著大于双亲。表明在群体水平上恶疫霉有性杂交后代具有较强的生活能力 ,提示同宗配合恶疫霉不同菌株间的有性重组 。

恶疫霉有性生殖交配行为的研究

对同宗配合疫霉种——恶疫霉（ＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｃｔｏｒｕｍＳｃｈｒｏｔｅｒ）抗甲霜灵突变株和抗地茂散突变株的抗药性在游动孢子和卵孢子后代的遗传分析，筛选到抗性分别由细胞核纯合显性单基因控制的抗甲霜灵突变株和由细胞质可稳定遗传的线粒体基因控制的抗地茂散突变株。将携带抗甲霜灵对地茂散敏感（即ＭｔｒＣｎｓ）标记的亲本与携带抗地茂散对甲霜灵敏感（即ＭｔｓＣｎｒ）标记的亲本共同培养，在２００个有性生殖单卵孢后代中检测到携带３种不同抗药性标记的单孢株，其中３２株携带ＭｔｒＣｎｓ标记，１６５株携带ＭｔｓＣｎｒ标记，另有３株同时携带双亲的标记性状即ＭｔｒＣｎｒ。结果表明：恶疫霉种内不同菌株共同培养时，有性生殖以配对亲本的各自自交为主，同时配对亲本间也可发生一定频率的杂交。

宝珠梨疫腐病病原菌研究

宝珠梨疫腐病是云南省的一种新记录病害 ,其病原菌为恶疫霉Phytophthoracactorum (LebertetCohn)Schrot.适宜恶疫霉分离培养的培养基是番茄汁培养基、V8汁培养基和PDA培养基。适宜恶疫霉生长的pH值范围在 3～ 10之间 ,最适pH值为 5～ 6 ,适宜生长的温度范围为在 10～ 30℃之间 ,最适生长的温度为 2 0～ 2 5℃ .恶疫霉对果糖、麦芽糖、蔗糖等碳源的利用好于其它碳源 ,对酵母膏、天门冬酰胺、牛肉膏等氮源的利用好于其它氮源。

陕西省猕猴桃疫霉病的诊断及病原鉴定

从西安霸桥、长安、户县、杨陵、周至、眉县等地采集猕猴桃疫霉病病株，经分离、纯化，结果认为：陕西省猕猴桃疫霉病的病原菌主要为鞭毛菌亚门卵菌纲，疫霉属的恶疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｃｔｏｒｕｍ（ＬｅｂｅｔＣｏｈｎ）Ｓｃｈｏｒｔ．），猕猴桃为该菌在国内的新记录寄主。同时还分析了陕西关中地区几种常见疫霉菌与恶疫霉菌的区别。

两株内生细菌在人参体内和根区土壤的消长动态研究

目的:研究内生生防细菌在人参根、茎、叶和根区土壤中的消长动态。方法:采用浓度梯度筛选法获得抗利福平标记菌株,灌根法接种标记菌株,稀释平板法计数标记菌株在人参根、茎、叶和根区土壤的分布情况。结果:通过抗生素诱导培养,最终获得了能够耐受120μg·mL-1利福平的标记菌株,其对人参黑斑病菌和人参疫病菌的抑制作用与诱导前未见明显改变。内生菌株ge15和ge25在人参根、茎中的初始菌落数最高,随后ge15和ge25在人参根、茎中的菌落数逐渐平稳并维持特定浓度;在人参叶中,两株菌在接种3天后菌落数达到最高,后逐渐降低直至趋于平稳;在人参根区土壤,ge15的菌落数往复变化,ge25的菌落数先上升后下降,最后菌落数趋于平稳。结论:两株内生菌均能够在人参根茎叶和根区土壤中维持特定菌群浓度,基于上述菌株的生防制剂将有助于人参病害的田间防治。

4株木霉对人参疫病菌、西洋参锈腐病菌的拮抗作用

利用4株木霉通过对峙法分别对人参疫病菌、西洋参锈腐病菌进行了体外拮抗作用的测定和评价。结果表明:4株木霉对人参疫霉菌、西洋参锈腐病菌均有一定程度的抑制作用,其中30371、30048、30153、30167对人参疫霉菌抑制率分别为70.45%、62.05%、47.39%、44.32%;30153、30048、30167、30371对西洋参锈腐病菌抑制率分别为55.00%、53.41%、52.73%、48.30%。

恶疫霉致病力和对甲霜灵敏感性的遗传与变异

以分离自黑龙江腐烂苹果的恶疫霉Phytophthora cactorum Schroeter野生型菌株Ap14为亲本，采用菌丝块创伤接种法测定了恶疫霉对苹果的致病力在无性繁殖和有性生殖后代的遗传。结果是连续2代单游动孢子后代在苹果上所致病斑半径分别为22.4~24.1mm和21.8~23.4mm，与亲本所致病斑半径22.5mm无显著差异；而其20个自交后代个体所致病斑半径为21.4~25.8mm，与亲本有显著差异，其中2株致病力显著强于亲本，其余与亲本相似。表明恶疫霉对苹果的致病力在无性后代可稳定遗传，而在自交有性后代发生分离。同时在含甲霜灵0.05μg/ml的LBA平板上测定了恶疫霉菌丝生长对甲霜灵的敏感性在无性和有性后代的遗传。结果是恶疫霉对甲霜灵的敏感性在无性单孢后代无显著变异，而在50个自交有性后代中，上述浓度对其菌丝生长的抑制率分布范围为67.3~97.1%，与亲本78.3%有极显著差异，其中3株高于亲本，3株低于亲本，44株与亲本相似。表明恶疫霉对甲霜灵的敏感性同样在无性后代稳定遗传而在有性后代发生变异。上述结果提示，供试恶疫霉菌株中上述性状可能由细胞核杂合基因控制。

利用mRNA差异显示技术克隆恶疫霉侵染诱导表达的草莓基因

为了解草莓与恶疫霉互作的分子机制,以接种后3、5和7 d的感病草莓品种‘FDP821’的冠部为材料,利用mRNA差异显示技术研究‘FDP821’与恶疫霉亲和互作前后基因表达的差异,获得78条差异表达的cDNA片段,通过分析从中分离出恶疫霉侵染诱导表达的10个草莓基因cDNA片段。BLASTX在线分析表明,这些草莓基因的功能涉及呼吸作用、衰老和核苷运输与代谢等。为阐明草莓与恶疫霉互作的分子机制提供了重要的线索。

草莓疫霉病病原菌鉴定

采集新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所草莓育苗网室内典型疫霉病症状的发病草莓短缩茎,进行组织培养、病原菌分离及纯化,并进行病原菌形态学及分子生物学鉴定。结果表明:发病草莓短缩茎分离得到的培养物在PDA培养基上的形态正反面无差异,分离纯化获得P1菌株;致病性结果表明,P1菌株在接种病原物的健康草莓短缩茎部位产生了病原菌菌丝;利用通用引物ITS1和ITS4对P1菌株DNA进行PCR扩增,得到大小约800bp的条带,获得片段与Phytophthora cactorumstrainGL1、BT1、TARI20179菌株的ITS序列同源性均为100%;结合形态学和分子生物学鉴定结果,确定致病病原菌为恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)。

氯唑灵诱导恶疫霉发生异宗配合变异与变异株交配型遗传

以化学农药氯唑灵诱变天然同宗配合恶疫霉Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｃｔｏｒｕｍ（Ｌｅｂｅｒ＆Ｃｏｈｎ）Ｓｃｈｒｏｔ的５个野生型菌株，从其中４个菌株获得了异宗配合变异株．氯唑灵的有效诱变浓度为１０～４０μｇ／ｍｌ，以２０μｇ／ｍｌ处理４～８周效果最好。所获得的异宗配合变异株在１２℃、黑暗条件下保存，２个月内有４０％左右的菌株保持异宗配合特性，７个月后仍有少数变异株保持异宗配合特性。异宗配合变异株的交配型在单游动孢子后代中发生分离，出现了Ａ1、Ａ２、Ａ１，Ａ2、Ａ１Ａ２、Ａ０５种交配型的菌株。上述各交配型在单游动孢子后代中均持续分离，在其单孢后代中检测到３～５种交配型的个体。上述结果提示疫霉属卵菌性别的产生是由同宗配合演化为异宗配合并可能同时分化产生不同的交配型，从遗传学角度阐明了自然条件下和实验室条件下疫霉菌交配型互变现象的可能机理。

恶疫霉有性杂交后代在土壤中的生长和游动孢子萌发研究

将恶疫霉突变株及其有性杂交后代的菌丝块 ( 2mm× 2mm)和游动孢子接种于灭菌土或自然土中 ,对它们的生长状况和游动孢子萌发率进行研究。结果显示 ,接种于灭菌土中的 7株杂交个体中 ,有 2株杂交个体的生长速率较快 ,其菌落半径分别为 8.0mm和 7.2mm( 3d) ,显著大于两亲本的菌落半径 (亲本AP1 4M-1 -52菌落半径为 3 .0mm ,另一亲本PK9Cn -2 -2 4生长较弱 ,不形成明显的菌落 ) ,其它杂交个体生长较弱 ,不形成明显的菌落 ;选择 3株杂交个体的游动孢子接种于灭菌土中 ,其中有两株杂交个体的游动孢子萌发率 (分别为 77.3 %和 71 .3 % )介于两亲本 (分别为 85.0 %和 67.7% )之间 ,但无显著性差异 (P =0 .0 5) ;另一杂交个体游动孢子萌发率 ( 59.7% )显著低于亲本AP1 4M -1 -52游动孢子萌发率 (P <0 .0 5)。而接种于自然土中的 7株杂交个体中 ,有 5株杂交个体长出少量菌丝和孢子囊 ,另 2株不生长 ;亲本菌株AP1 4M -1 -52有少量菌丝扩展和产生孢子囊 ,另一亲本菌株PK9Cn -2 -2 4无菌丝扩展 ;恶疫霉有性杂交个体及其亲本的游动孢子在自然中均不能萌发。结果表明恶疫霉有性杂交后代营养体和游动孢子在土壤中的生活能力与亲本相似。

恶疫霉生长速率与同宗配合性状的遗传与变异

在实验室条件下 ,对不同地区和不同寄主来源的恶疫霉菌株的线性生长速率和同宗配合性状的遗传进行了研究。结果指出 :恶疫霉菌株同宗配合性状在无性和有性后代均可稳定遗传 ,表明在供试恶疫霉菌株中上述性状的控制因子是纯合的。供试菌株生长速率的遗传情况十分复杂 ,至少存在 3种类型 :1 在单孢无性后代和自交后代均可稳定遗传 ;2 在单游动孢子后代稳定遗传而在自交后代发生变异 ;3 在无性后代和有性后代均发生变异。表明该性状可能由细胞核纯合基因、也可能由细胞核杂合基因。

文山三七疫病病原菌的分离与鉴定

对发生于文山地区的三七疫病发病部位进行观察和症状描述,并对文山县的追栗街、小街腰店、老回龙,马关县的八寨、雾路者、马白镇下寨、浪桥乡等不同海拔地区的三七疫病病样进行病菌分离、病菌的形态学特征观察以及病原菌的致病性测定,明确了病菌在文山地区不但能侵染三七植株的地上部位,还能引起地下部分的种腐和根腐,是目前三七生产中一个重要病害,病原菌为恶疫霉Phytophthora cactorum(Leb.etCohn)Schr et。

三七疫霉病拮抗根际土壤细菌的筛选及初步鉴定

为了筛选对环境友好的生防细菌防治三七疫霉病,通过高温处理、稀释涂布法分别从三七健康及患病植株根际土壤分离了21和16株可培养细菌,并以对峙培养法分别筛选到6和7株拮抗菌株,上述13株拮抗菌株经生理生化特征鉴定为芽孢杆菌属。结果表明,健康植株根际土壤有较丰富的可培养细菌,而患病植株根际土壤可培养细菌中的拮抗菌株较丰富,表明健康植株与患病植株根际土壤的拮抗细菌丰度发生了变化。解淀粉芽孢杆菌B1的抑菌带宽达8.5mm,具有一定的潜在生防价值。