利用16S-23S rDNA RFLP及16S rRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌系统发育的研究

采用16S-23S rDNA间隔区段(IGS)PCR-RFLP与16S rRNA基因部分序列分析的方法对饭豆根瘤菌进行了遗传多样性及系统发育分析.由16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析可知,所有菌株在52%的相似性水平上聚在一起,形成了慢生型菌群与快生型菌群这两大菌群.群Ⅰ中,在79%相似性的水平上分为ⅠA与ⅠB两个分支.群Ⅱ中,在62%相似性的水平上分为ⅡA与ⅡB两个分支,分支ⅡA在72%的相似性水平上进一步分为ⅡA1、ⅡA2和ⅡA3三簇;分支ⅡB中的饭豆根瘤菌与标准菌株USDA205T聚在一起,表现的差异并不大.由16SrRNA基因部分序列分析结果可知,供试的4个代表菌株分别位于不同的系统发育分支中.CYR4243与Sinorhizobium fredii的模式菌株USDA205T的序列相似性达到了99.87%.HCY1101与Rhizobium leguminosarum中的三叶草生物型(bv.trifolii)和豌豆生物型(bv.viceae)这两个生物型的参比菌株亲缘关系最近,序列相似性为100%.HCY5202与R.galegae亲缘关系最近,序列相似性为99.86%.CYY3302与Bradyrhizobium elkanii的参比菌株USDA86有最近的亲缘关系,序列相似性近似于100%.

从我国20种感病植物中扩增植原体16SrDNA片段及其RFLP分析

本研究收集了２０种感染植原体的植物材料，从患病材料和相应健康植物组织中提取总ＤＮＡ用作ＰＣＲ模板，选择两对通用引物进行巢式ＰＣＲ，扩增植原体的１６ＳｒＤＮＡ片段，回收扩增产物，通过限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析进行分类。２０种患病植物材料中的植原体有１３种属于翠菊黄化种，２种属于白腊树黄化种，３种属于花生丛枝种，２种属于三叶草丛生种。

PCR-RFLP法分析白酒小曲细菌多样性

采用CTAB法提取白酒小曲细菌总DNA,用细菌通用引物扩增16S rDNA,并构建16S rDNA克隆文库。采用限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)技术对16S rDNA文库进行分析,获得76个克隆的酶切指纹图谱。选择酶切带型不同的阳性克隆进行测序并且构建进化树。结果表明,小曲主要细菌种类为黄单胞菌属、沙雷氏菌属、乳杆菌属、木崎氏菌属和片球菌属,其中优势细菌是以戊糖片球菌为主的乳酸菌。

攀西地区葛藤根瘤菌的RFLP遗传多样性

利用16S rDNA PCR-RFLP和16-23S IGS PCR-RFLP技术对分离自四川攀枝花的43株葛藤根瘤菌进行了遗传多样性研究。供试菌株的16S rDNA用HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和TaqⅠ酶切后具有16种遗传图谱类型。16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析结果表明,在53%的相似性水平上,供试菌株与参比菌株分为两个分支,在81%的相似水平上所有菌株分为13个群。

四川宜宾芽菜中乳酸菌分离筛选及菌相分析

采用6种选择性培养基对宜宾芽菜中的乳酸菌进行分离纯化,通过pH值测定和乳酸定性,筛选出72h时pH值在4.0以下和产生乳酸与标样Rf值相近的菌株进行后续实验。采用16S rDNA PCR-RFLP、ERIC-PCR对筛选出的菌株进行遗传多样性分析,通过分析16S rDNA序列研究宜宾芽菜中乳酸菌菌相及其系统发育。16S rDNA PCR-RFLP和ERIC-PCR指纹图谱分析结果表明宜宾芽菜中乳酸菌遗传多样性丰富。根据16S rDNA PCR-RFLP和ERIC-PCR聚类图分析,选取中心菌株进行序列分析,并构建系统发育树,结果显示:宜宾芽菜中主要的乳酸菌为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、坚强肠球菌(Eenterococcus durans)。

微生物非培养鉴定技术在临床标本检查中的应用研究

感染性疾病的病原学诊断仍以微生物的分离培养作为"金标准",但能培养成功的仅为少数。绕过分离培养环节,以微生物rRNA/rDNA基因作为种属鉴别序列,设计通用引物(universal primer,up),用PCR扩增标本中微生物的16S rRNA或16S～23S rRNA序列,通过毛细管电泳(CE)进行单链构象多态性(SSCP)和限制性片段长度多态性(RFLP)分析,筛选基因的点突变以达到快速鉴定微生物(到属和种)。用PCR-CE-SSCP和PCR-CE-RFLP分析系统检测了呼吸道、消化道、女性生殖道标本中感染的病原菌;用PCR-CE-SSCP系统检测了男性泌尿道溶脲脲原体两个生物群。建立PCR-CE-RFLP分析系统,用非培养法鉴定技术检测脓汁、肠道和泌尿生殖道标本,检测并鉴定了临床标本中的多种病原菌;对人体肠道菌群进行定性和定量分析,用该法可协助腹泻的病原学诊断;检测生殖道常见的致病菌;用PCR-CE-SSCP系统建立了检测溶脲脲原体两个生物群的方法。微生物的非培养鉴定技术比传统方法缩短20h,为临床感染症的诊断提供快速、准确的依据。结果可见,利用16S～23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP和PCR-CE-SSCP系统可以达到对临床常见病原菌的快速种属鉴定,比传统的细菌培养法具有快速、准确、灵敏的优点,可用于临床感染症的病原学诊断。微生物的非培养鉴定技术将替代培养法而成为病原学诊断新的金标准。

四川冬菜及发酵液中产酸菌的多样性和群落结构

采用6种培养基对四川冬菜和发酵液中的产酸菌进行分离纯化,挑选出37株作为供试菌株。通过对37株菌株发酵产酸能力的测定、乳酸定性分析以及16S rDNA RCP-RFLP分析结果,最终选择17株菌株进行测序,并构建系统发育树。实验结果表明,所有供试菌株均有一定的产酸能力,其中大部分菌株产酸能力较好,且70%的菌株发酵过程中会产生乳酸。冬菜和发酵液中的产酸菌具有一定的多样性,主要为乳酸菌中的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和肠球菌(Enterococcus)及普通细菌葡萄球菌(Staphylococcus)。另外,腌制时间对冬菜和发酵液中产酸菌的菌相组成影响很大,在腌制4年的冬菜(H)中还检测出与致病性溶血性葡萄球菌相似性很高的菌株,说明腌制时间过长的冬菜其品质难以保证。

佳西热带雨林土壤芽胞杆菌分离与多样性分析

采用热处理法从海南省佳西热带雨林土壤中分离到147株芽胞杆菌，并利用16S rDNA PCR -RFLP与序列分析技术对其遗传多样性进行了研究。16S rDNA PCR -RFLP 酶切图谱 UPGMA 聚类分析结果表明，在100%的相似性水平上，这些芽胞杆菌分属13个遗传类群。不同遗传类型代表菌株的16S rRNA 基因序列分析结果显示，它们分布在 Bacillaceae、Planococcaceae 和 Paenibacillaceae 科的 Bacillus、Lysinibacillus、Paucisaliba-cillus、Bhargavaea 和 Paenibacillus 五个属，其中 Bacillus 为优势属（占50%）；有3株芽胞杆菌的16S rRNA 基因序列与数据库中相应模式菌株的最大相似性在98.3%~98.9%之间。结果表明，佳西热带雨林土壤中芽胞杆菌有着较为丰富的遗传多样性。

自然发酵酸菜中乳杆菌的分离鉴定与多态性分析

以自然发酵的东北酸菜汁液为实验样品,对其中的乳杆菌进行了分离纯化,共得到乳杆菌34株;使用生理生化实验对其中的10株乳杆菌进行了鉴定;并采用16S rDNA PCR-RFLP方法对这10株乳杆菌进行了遗传多态性的分析。结果表明它们分属5个遗传型。

龙葵内生细菌的分离鉴定和多样性研究

采用16 S rDNA PCR-RFLP和16 S rDNA基因全序列分析的方法,对从龙葵植株中分离得到的37株内生细菌进行多相分类和系统发育研究,结果显示共有18种16 S rDNA基因型,在系统分类上归属于8个属,分别为短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和鞘脂杆菌属(Sphingobacterium)。其中,菌株S-30与模式菌株Brevibacterium frigoritolerans DSM8801T的相似度仅为94.9%,是一个潜在的新种。试验结果揭示了龙葵根、茎、叶组织中内生细菌的多样性及其系统发育地位。

华北及西北地区岩黄芪根瘤菌的表型及遗传多样性

选用分离自河北、内蒙古等5省区的岩黄芪根瘤菌30株及17株已知参比菌株,进行了营养利用、抗生素抗性、耐逆性及生理生化反应等12 5项表型性状研究,所得数值分类树状图表明不同宿主及不同地域的岩黄芪根瘤菌的表型多样性。通过对其中部分菌株进行16 S r DNA PCR- RFL P及BOX- PCR指纹图谱分析,聚类结果表明供试岩黄芪根瘤菌具有遗传多样性。

福建永安市辣椒丛枝病植原体的分子检测及鉴定

永安地区发病辣椒植株表现小叶、黄化、丛枝、簇芽等症状。利用植原体16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR2和R16F2n/R16R2,对发病辣椒植株总DNA进行巢式PCR检测,获得约1.2kb的特异性DNA片段。经测序并在GenBank数据库进行比对分析,共获得4条植原体特定的16SrDNA基因序列(CHY-C4-1、CHYY1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1)。将测得的4条序列与已报道的植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,结果显示获得的4条植原体序列均聚类到16SrI组,其中CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1与16SrI-B亚组植原体聚类到同一支,而CHY-C4-1与已报道的16SrI组内的6个亚组均未聚类到一支,因此建议将CHY-C4-1命名为新的亚组。利用iPhyClassifier在线分析软件对获得的4条植原体序列进行虚拟RFLP分析,结果与进化树获得的结果一致。

四川攀西干热河谷区根瘤菌的多样性研究

采用数值分类、BOXAIR-PCR和16S rDNA PCR-RFLP方法,对分离自四川攀西干热河谷区11种豆科植物上的43株根瘤菌的表型和遗传多样性进行了研究.数值分类结果表明,攀西地区根瘤菌具有极大的表型性状多样性,在80%相似性水平上绝大多数供试菌株单独成群,能耐60℃(10min处理)的高温,在低温(10℃)或者低pH(4.0)条件下生长很差.与数值分类结果相比较,BOXAIR-PCR的分群结果更分散,说明供试菌株在遗传性状上也具有多样性.在数值分群基础上,选取15个代表菌株进行16S rDNA PCR-RFLP分析.结果表明,供试的15株代表菌株遗传差异明显,仅CCBAU61224与Rhizobium leguminosarum USDA2370T,CCBAU61303与Agrobacterium tumerfacienseIAM13129T具有相同的遗传图谱类型.数值分类和16S rDNA PCR-RFLP分析具有较好的一致性,BOXAIR-PCR适合于对根瘤菌种内菌株间的遗传多样性研究.

上海地区不同植物根际荧光假单胞菌多样性

荧光假单胞菌是一种常见的植物根际促生细菌,有开发作为生物农药的潜质.以分离自上海周边地区12种植物根际的104株荧光假单胞菌为研究对象,进行了表型分类,并采用16S-rDNA RFLP和REP-PCR技术,系统地研究了荧光假单胞菌的遗传多样性.结果表明:16S-rDNA RFLP酶切图谱聚类分析在85%相似性水平上,可将供试菌株划分为9群;REP-PCR指纹图谱聚类分析在76%相似性水平上,可将供试菌株划分为26群,说明上海地区的荧光假单胞菌具有丰富的遗传多样性;聚类分析结果还显示出菌株间亲缘关系与其分离地和所在植物具有相关性,表明环境条件对荧光假单胞菌的发育和遗传分化有重要影响.

贵州主栽樱桃品种的植原体分子检测及鉴定

为确定贵州主栽樱桃品种玛瑙红、黑珍珠发生的花变叶、丛枝现象的病原分布、种类及其分类地位,本研究优化植原体16 S rDNA基因通用引物对R 16 mF 2/R 16 mR 2和R 16 F 2 n/R 16 R 2的巢氏PCR反应体系,同时对86个樱桃样品总DNA进行巢式PCR扩增,对扩增PCR产物进行克隆、测序及序列分析。结果表明,纳雍县、福泉市、乌当区等地样品植原体检出率高达100%;威宁县、沿河县、大方县分别为40.74%、66.67%和40%;序列同源性比较表明,获得的GZ-1、GZ-2植原体序列属于16 Sr V组;系统进化树及虚拟RFLP分析显示,GZ-1植原体序列属于16 Sr V-B亚组成员,GZ-2序列为16 Sr V组新的亚组。本研究确定了贵州主栽樱桃品种的植原体病害侵染情况,明确了其分类地位,为该病害检测和防控提供一定理论依据。

柳树丛枝病病原分子鉴定

柳树(Willow)是杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)乔木植物,大多数品种具有耐旱耐盐碱的特性,对环境具有良好的适应能力[1]。柳树在甘肃省内广泛种植,是风景林、防护林和水土保持林的重要组成树种。柳树丛枝病是一种典型的植原体病害,当寄主植株被病原物侵染时,顶芽生长受到抑制而侧芽提前萌发,导致受害枝条无法正常抽条或木质化,严重时甚至引起整株枯死[2],对林业的生态、经济和社会效益造成了极大损失。近年来,柳树丛枝病在甘肃省各市州发生严重,已经引起省内各界的普遍关注。

柳树黄化病植原体的分子分类

【目的】柳树黄化病是一种重要的植原体病害,本研究旨在明确柳树黄化病植原体(Willow Yellow phytoplasma,WY)的分类地位,为进一步开展致病性和防治研究奠定基础。【方法】采用植原体特异引物通过PCR方法从患病植株DNA中扩增植原体16S rDNA基因和核糖体蛋白基因(ribosomal proteins gene,rp),对所得的序列进行分析,构建同源进化树,并用限制性片段长度多态性(RFLP)对巢式PCR产物进行分析。【结果】首次从柳树黄化病植原体中分离出了16S rDNA基因和rp基因,大小分别为1246bp和1212bp。通过对植原体16S rDNA和rp基因的核苷酸同源性比较和RFLP分析,发现该分离物与16SrI组的核苷酸同源性均在99%以上,与16SrI-C亚组中的小麦蓝矮病植原体同源性高达99.8%(16SrDNA)和99.6%(rp),且RFLP分析与16SrI-C亚组的植原体有相同的酶切条带。【结论】柳树黄化植原体应划分于16SrI-C亚组。

八门湾红树林土壤芽胞杆菌分离与多样性分析

【目的】了解八门湾红树林海漆林区土壤中可培养芽胞杆菌资源的多样性。【方法】采用水浴处理与直接涂布相结合的方法选择性分离土壤中的芽胞杆菌;利用16S rDNA PCR-RFLP与16S rDNA序列分析技术研究可培养芽胞杆菌资源的遗传多样性和系统发育关系。【结果】16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱UPGMA聚类分析表明,在100%的相似性水平上,分离的155株芽胞杆菌分属21个遗传类群,显示了较为丰富的遗传多样性;由21种遗传类型代表菌株的16S rDNA序列分析结果得知,这些芽胞杆菌主要分布在Bacillaceae和Paenibacillaceae科下的Bacillus、Halobacillus、Virgibacillus和Paenibacillus 4个属,其中Bacillus为优势属;有8株芽胞杆菌的16S rDNA序列与数据库中相应模式菌株的最大相似性在95.1%-99.0%之间。【结论】八门湾红树林土壤可培养芽胞杆菌有着较为丰富的遗传多样性,并存在新的芽胞杆菌物种资源。

假臭草丛枝病植原体鉴定与多样性分析

研究假臭草丛枝病植原体的多样性,并确定其分类地位,对于利用假臭草丛枝病植原体对假臭草进行生物防治具有重要的意义。本研究采集了海南省8个地区的假臭草丛枝病样品,采用PCR以及巢式PCR方法扩增了假臭草丛枝病植原体的16S rDNA序列片段,进一步选用AfaI、AluI、EcoRI、HaeⅢ、HpaⅡ、HhaI、HinfI、KpnI、Sau3AI、TaqI和XspI等11种限制性内切酶对巢式PCR产物进行酶切分析(RFLP),并对16SrDNA序列进行测序,确定假臭草丛枝病植原体多样性和生物学地位。结果发现:假臭草丛枝病的病原确为植原体;8个地区的假臭草丛枝病植原体的酶切图谱基本一致,与已知植原体的相似度为0.26～0.97;8个地区假臭草丛枝病植原体的序列同源性均在99.4%以上,应为同种植原体;假臭草丛枝病植原体与16S rRNA Ⅱ-A组的花生丛枝病(PnWB)的同源性最高达到99.1%,说明假臭草丛枝病植原体在分类学地位上应归属于植原体16Sr RNA Ⅱ-A组。

猪牛沼液施用对土壤细菌多样性的季节性影响

采用PCR-RFLP法分析了灌溉猪沼液、牛沼液和施用化肥的土壤细菌多样性的季节性变化。通过直接提取土壤DNA,扩增细菌16S rDNA基因片段,建立克隆文库,用限制性内切酶AfaⅠ和HindⅢ进行酶切,得到了96～123种酶切类型。采用多样性测度对试验结果进行统计分析。结果表明,细菌多样性指数H′、Ds、Dg、dMa、R2和E变化规律为:施用猪沼液处理组>施用牛沼液处理组>对照组(P<0.05),Simpson指数λ则表现为对照组>牛沼液组>猪沼液组(P<0.05),细菌群落的均匀度指数Jgi和种间相遇机率的PIE指数均为猪沼液组>牛沼液组>对照组(P<0.05);细菌多样性指数H′、dMa、R和λ的变异系数在2.65%～18.87%之间,尤以Simpson指数λ变化最为敏感,处理间差异最大。最终得到如下结论:处理以及季节对细菌多样性的影响极显著,不同处理土壤细菌多样性为猪沼液组>牛沼液组>对照组,春季细菌多样性高于秋季;实施种养结合循环利用模式3年后,土壤细菌多样性有不同程度的提高。