Pi9基因标记辅助选择改良水稻不育系金23A稻瘟病抗性

以携带广谱持久的抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75–1–127为供体亲本,以保持系金23B及其不育系金23A为受体亲本,采用Pi9基因共显性标记CoInDF1R2进行MAS回交育种,以改良三系不育系金23A及其保持系金23B的稻瘟病抗性;用25份稻瘟菌代表性菌株进行室内苗瘟接种,观察苗瘟抗性表现。结果显示:金23A和金23B的抗性频率仅为28%,而75–1–127的抗性频率为92%;田间病圃抗性鉴定结果显示,75–1–127高抗苗瘟,而金23A和金23B受体亲本均高感苗瘟;共显性标记CoInDF1R2在75–1–127基因组上扩增出大小为354 bp的PCR产物,对金23A或金23B基因组的扩增产物大小约470 bp,说明该标记在2个亲本间的多态性明显且稳定;利用CoInDF1R2开展连续多年MAS回交育种实践,培育出了农艺性状优良、丰产性较好的抗病不育系金23A–Pi9–1及抗病保持系金23B–Pi9–1,为三系法杂种优势利用提供了新的抗稻瘟病亲本材料。

分子标记辅助选择Pi9基因改良水稻不育系桃农1A稻瘟病抗性

以籼稻品系75-1-127为广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的供体亲本,先后以三系保持系桃农1B及其不育系桃农1A为受体亲本,利用Pi9基因内共显性InDel标记CoInDF_(1)R_(2)开展MAS回交育种以定向改良桃农1A稻瘟病抗性。分子标记CoInDF_(1)R_(2)在75-1-127基因组中扩增出1条大小为354 bp的条带,而在桃农1B和桃农1A基因组中扩增条带大小约为470 bp。分别以75-1-127与CO39作为抗病对照与感病对照进行室内人工接种,得到桃农1A、桃农1B及其改良不育系和保持系的抗菌谱,结果显示,75-1-127的抗性频率为86.67%,桃农1A与桃农1B的抗性频率均为6.67%,而改良不育系桃农1A-Pi9及其保持系桃农1B-Pi9的抗性频率同75-1-127,且田间病圃表现高抗苗瘟。经田间不育特性、农艺性状与产量结构调查分析,育成1个高抗稻瘟病、不育性彻底且稳定、柱头外露率高、包颈粒率低、农艺产量性状优良的新不育系桃农1A-Pi9-1及其配套保持系桃农1B-Pi9-1,实现了桃农1A稻瘟病抗性的定向改良。

水稻Pi9位点6个稻瘟病抗性基因特异分子标记的开发及应用

【目的】水稻Pi9位点由多个串联的同源NLR基因组成,从中已克隆了超过10个优良的稻瘟病抗性基因。论文旨在鉴别水稻亲本Pi9位点抗性基因的组成,促进该位点基因快速、精准地应用于水稻抗性育种。【方法】对比Pi9位点已克隆抗性基因的序列,从中发掘各基因特异的核苷酸位点;然后将各目标基因分别与数据库(Rice Resource Center)中的155个水稻基因组进行比对分析,进一步从中筛选出特异最强的核苷酸位点,用于Pi2、Piz-t、Pi9、Pi9-type5、PigmR和Pid46个抗性基因特异分子标记的开发;以24个抗稻瘟病单基因系、阳性对照和110个四川盆地水稻亲本为鉴定对象,通过优化PCR扩增条件、测序或基因组数据分析检验分子标记鉴定结果的准确性。由于该位点基因的同源性较高、基因间常常拥有一些相同的特异位点,导致许多抗性基因很难用一对分子标记进行精准鉴定,因此采用多对分子标记共同鉴定的方式;另外许多特异位点为单碱基差异,因此需要对差异位点旁的碱基进行特异突变,使引物的3′端具有两个碱基的错配,以提高PCR扩增的特异性。【结果】最终为6个Pi9位点的抗性基因开发了有效的分子标记,发现32.09%的参试水稻材料含有Pi9位点抗性基因。Pi9、Pid4、PigmR、Piz-t、Pi2和Pi9-type5分别存在于1、7、8、14、23和33个水稻材料中,其中Pi9仅存在于单基因系中。这些抗性基因通常两个或多个组合在一起,同时存在于一个水稻材料中。其中Pi9-type5往往与Pi2或Piz-t成对出现,仅在成恢993、HR2168和绵恢3653个亲本中单独存在。雨恢38含有的Pi9位点抗性基因最多,分别有Pi2、Pi9-type5、PigmR和Pid4。川谷B、川农4B、内香6B和双1B中均同时含有Piz-t、PigmR和Pid43个抗性基因。千乡654B中含有Piz-t和Pid4两个抗性基因。【结论】为Pi9位点的6个同源稻瘟病抗性基因开发了特异的分子标记,明确了四川盆地110个水稻亲本Pi9位点的抗性基因组成,揭示了Pi9位点抗性基因丰富的组合形式,为水稻育种的抗原选择提供了明确参考。

利用Pi9基因序列标记辅助选择改良籼稻稻瘟病抗性

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9基因序列设计的特异分子标记Pi9–a,通过回交育种和分子标记辅助选择技术,改良8份受体水稻材料(丰源B、Ⅱ32B、天龙香103、香丰187、明恢63、轮回422、R747、25H003)的稻瘟病抗性。结果表明:分子标记Pi9–a对8份受体亲本与Pi9供体亲本75–1–127间进行的多态性检测中,除香丰187外,其余7个组合间均存在稳定明显的多态;对4个BC1F1群体进行随机取样的基因型和表型鉴定中,Pi9–a对抗稻瘟病表型选择的效率均为100%。

广谱抗性基因Pi9在黑龙江省水稻品种中的分布

2014年利用显性标记p B8对黑龙江省96份水稻主栽品种筛选Pi9基因,对供试材料作苗期和分蘖期抗病鉴定,明确Pi9基因在黑龙江省水稻品种中分布情况及应用价值。结果表明,供试材料中,有早熟青森、垦粳1等44个品种含有Pi9基因,苗期和分蘖期平均发病级别均为2.4级;青森5号、长白9号等52个品种不含Pi9基因,苗期和分蘖期平均发病级别分别为5.1和5.4级。研究结果可为黑龙江省水稻品种改良以及抗病资源合理利用奠定基础。

抗稻瘟病基因Piz-t和Pi9连锁标记开发及在云南粳稻中的应用

云粳优5号、云资粳41号和楚粳28号是农艺性状优良但对稻瘟病抗性弱的粳稻品种,采用回交的方法将2个广谱抗稻瘟病的基因Piz-t和Pi9导入这些品种以改良这3个品种的抗稻瘟病特性。为提高后代抗病材料选择的准确性和效率,本研究开发获得5个与Piz-t和Pi9基因紧密连锁并且在供体亲本和受体亲本间具有多态性的分子标记。利用分子标记跟踪检测来源于供体亲本与受体亲本回交获得的BC1F1单株中Piz-t和Pi9基因,并进一步利用对受体亲本云粳优5号、云资粳41号和楚粳28号致病,但对持有Piz-t和Pi9基因的供体亲本不致病的稻瘟病菌09BSH-10-5A进行接种分析。结果显示,携带有供体亲本和受体亲本DNA片段的杂合单株均表现抗病,而仅携带受体亲本DNA片段的个体均表现为感病。表明所开发的5个分子标记可用于抗病育种的分子标记辅助选择,有效提高抗病材料选拔的准确性与效率,创制新的抗源材料。

聚合抗褐飞虱基因bph20(t)和bph21(t)及抗稻瘟病基因Pi9水稻株系筛选

【目的】筛选聚合抗褐飞虱和抗稻瘟病基因水稻材料,为培育新型抗褐飞虱兼抗稻瘟病的水稻新种质提供参考。【方法】利用常规育种、分子标记辅助育种和抗病虫鉴定相结合的手段,将抗稻褐飞虱基因bph20(t)和bph21(t)以及广谱高抗稻瘟病基因Pi9聚合到优良保持系博ⅢB的遗传背景中。【结果】bph20(t)的分子标记RM540和BYL7、bph21(t)的分子标记RM5348和RM222未在稻褐飞虱抗、感亲本间扩增出特异条带,无明显的多态性,不能用于该育种群体抗褐飞虱基因bph20(t)和bph21(t)的检测。Pi9的显性分子标记pB8以及共显性分子标记PB9-1在稻瘟病抗、感亲本之间可扩增获得特异条带,具有多态性,可用于Pi9基因的检测。经抗虫鉴定并利用标记PB9-1对BC6F2群体的22株材料进行PCR扩增,含有Pi9基因杂合体的有10株,纯合体有6株,不含Pi9基因的有7株。用源自广西南宁田间感褐飞虱和稻瘟病菌株进行多次抗病虫鉴定,筛选获得一批抗褐飞虱材料,其中抗性与抗虫亲本BPH54相当的材料有6份,在这6份材料中含有Pi9基因且抗稻瘟病的材料有5份,对稻褐飞虱的抗性与供体亲本BPH54水平相当。【结论】通过常规育种、分子检测和抗虫鉴定相结合的办法,筛选获得5份聚合褐飞虱抗性基因(bph20和bph21)和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中间材料,为选育新的双抗保持系和不育系提供种质材料。

籼稻1701转Pi9基因株系的遗传分析及抗瘟性鉴定

利用农杆菌介导法将广谱抗稻瘟病基因Pi9导入籼稻品种1701中,得到了大量的T1代和T2代转基因植株.对T2代植株进行遗传分析和稻瘟病抗性鉴定,结果表明,外源基因Pi9已转入到受体基因组中,并在T2代植株中得到表达.

广谱抗稻瘟病基因Pi9对籼稻的转化研究

通过农杆菌介导法,将由CaMv35s启动子启动的广谱抗稻瘟病基因Pi9转入5个籼稻品种(丰源B、湘晚籼13号、R996、527、1701)的愈伤组织中,所用质粒为pCAMBIA1301,pCAMBIA1301的T-DNA区含有潮霉素(hygmycin)抗性基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因。以潮霉素作为筛选剂对籼稻愈伤组织进行筛选,结果表明,不同品种在转化过程中抗性愈伤率在73.9%￣83.3%之间,获得的部分抗性苗经PCR检测为阳性,阳性植株的转化率差异显著,其转化率为5.7%￣25.9%之间,对获得的抗性苗和T2代幼苗的根和叶进行GUS组织化学染色分析,有些抗性苗和T2代幼苗的根和叶呈蓝色反应,表明广谱抗稻瘟病基因Pi9基因已整合到水稻基因组并能正常表达。对T2代进行稻瘟病小种接种试验,结果显示了抗性分离。并且建立了一套较为有效的水稻遗传转化体系。

陕西省水稻种质资源中Pi9基因的分布状况

【目的】明确陕西省主要稻种资源中Pi9基因的分布状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。【方法】利用抗稻瘟病抗性基因Pi9的显性标记PB8和共显性标记PB9-1对2012年长江上游国家水稻区域试验材料62份、陕西省水稻区域试验材料99份及陕西省水稻研究所原始材料圃331份材料进行Pi9基因位点检测。【结果】在161份区试材料中,13份为抗性基因纯合体,18份为抗性基因杂合体,其余为感性基因纯合体。331份材料原始材料中,18份为抗性基因纯合体,15份材料未检测出条带,其余均为感性基因纯合体。【结论】陕西省主要水稻种质资源中Pi9基因所占比例较少。

宁夏水稻品种抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的检测分析

为明确宁夏水稻品种中抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的分布情况,为宁夏水稻抗穗颈瘟病的分子标记辅助选择育种奠定基础。利用Pi-ta、Pi-b和Pi9 3个与抗稻瘟病基因紧密连锁的功能标记,对94份宁夏水稻品种进行抗稻瘟病基因的分子检测。结果表明,宁夏水稻品种中含Pi-ta抗性基因的占46.8%,含Pi-b抗性基因的占93.6%,含Pi9抗性基因的占27.7%,同时含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的占44.7%,同时含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的占12.8%。根据报道,Pi-ta、Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性正相关系数为0.71,表明从宁夏水稻品种中选育抗穗颈瘟品种是有基因基础的。

用分子标记对部分高代育种材料抗稻瘟基因Pi9(t)的检测

用分子标记PB8对课题组新育成的部分高代育种材料进行抗稻瘟病基因Pi9(t)的检测,检测到27份材料中含Pi9(t)基因1、1份材料含Pi9(t)纯合基因。对含Pi9(t)纯合基因的材料进行了四川主要稻瘟病生理小种的接种鉴定,其抗性频率达78.13%～87.50%,表明Pi9(t)基因是四川稻区稻瘟病的主效抗病基因,对四川主要稻瘟病生理小种表现出较高的抗性。

利用分子标记辅助选择聚合Xa4、Xa23和Pi9基因

利用常规回交育种结合分子标记辅助选择技术,将高抗水稻白叶枯病Xa4和Xa23基因、广谱高抗稻瘟病Pi9基因聚合到同一株系中,获得了三基因聚合的纯合株系。选用广西具有代表性的13个稻瘟病菌株、白叶枯病广致病型菌系P6和中国7个流行菌系对杂交后代进行人工接种鉴定,结果表明,聚合了Xa4、Xa23和Pi9基因的株系09-371、09-375能同时抗白叶枯病和稻瘟病,对白叶枯病抗谱和抗性水平与供体材料W7相当,对稻瘟病的抗性与供体亲本75-1-127水平相当。Xa4、Xa23和Pi9三基因纯合株系可以作为水稻育种的多抗供体材料。

抗稻瘟病 Pi2/9/z-t 基因特异性分子标记的开发

通过对已克隆的抗稻瘟病基因Pi2、Pi9以及Piz-t进行序列比对,寻找各自特异的核苷酸差异,成功开发了基于PCR技术以及电泳检测技术的Pi2/Pi9/Piz-t以及Piz-t的基因特异性分子标记,能有效地将Pi2/Pi9/Piz-t与该位点上的其他抗性等位基因及感病等位基因区分开,这为分子标记辅助育种及抗病基因聚合提供有效的分子标记。用Pi2/Pi9/Pizt基因特异性分子标记对来自全国各稻区的共101份水稻品种和育种亲本进行分子检测,结果发现,除2个品种检测到Piz-t带型之外,大部分水稻品种不携带这3个抗性基因,这为有目的地开展品种的抗性改良提供了重要的参考信息。

利用分子标记辅助选择将抗稻瘟病基因Pi-9(t)渗入水稻恢复系泸恢17

本研究采用杂交和分子标记辅助选择技术,将亲本材料P2的水稻广谱高抗稻瘟病基因Pi-9(t)导入杂交水稻恢复系泸恢17,再利用抗稻瘟病基因Pi-9(t)的特异分子标记pB8检测该目的基因,获得68份携有Pi-9(t)基因型的回交株系。基因型鉴定表明株系WR1023、WR1043、WR1056和WR1062为均含有Pi-9(t)基因纯合的回交后代株系。表型分析表明WR1023和WR1056株系农业性状已稳定,且其株叶型、抗稻瘟病及配合力较好,我们认为可以用作育种抗性亲本材料。

水稻Pi9基因序列标记的开发及其抗瘟育种应用

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9的3'UTR序列设计特异DNA标记pi9utr,通过分子标记辅助选择和连续回交育种实践,改良7份籼稻亲本(316B、金23B、R207、R228、R288、R389、明恢86)的稻瘟病抗性。结果表明:pi9utr是一个高效显性分子标记,除R207外,在其余6份受体亲本与Pi9供体亲本75-1-127间均存在明显而稳定的多态;在室内接种后的316B×75-1-127 BC4F1群体和R288×775-1-127 BC6F1群体中随机取样,进行稻瘟病抗性表型和基因型鉴定及Pi9基因表达分析,证明pi9utr对两个组合回交后代个体的抗病性辅助选择效率均为100%,且在所有抗病单株中均能检测到Pi9基因的高效表达,在所有感病单株中均没有检测到Pi9基因的表达。利用pi9utr在回交世代中的连续辅助选择,获得了3个组合的BC4F1及3个组合的BC6F2代群体,为选育抗稻瘟病新品种打下了基础。

分子标记辅助选择聚合Xa23,Pi9和Bt基因

利用分子标记辅助选择将高抗水稻白叶枯病的Xa23基因、广谱高抗稻瘟病的Pi9基因、抗水稻螟虫和稻纵卷叶螟的Bt基因聚合到同一株系中,获得了三基因聚合的纯合株系。病、虫抗性鉴定结果显示:聚合了Xa23、Pi9和Bt基因的株系HB1471、HB1473能同时抗白叶枯病、稻瘟病和稻纵卷叶螟;与Xa23、Pi9基因的供体材料L10相比,对白叶枯病和稻瘟病的抗谱相同、抗性水平相当;对稻纵卷叶螟抗性与Bt基因的供体亲本MH63-Bt水平相当。Xa23、Pi9和Bt三基因纯合株系可以作为水稻育种的多抗供体材料。

黄淮稻区推广水稻品种稻瘟病抗性基因Pi9和Pi-ta的分子鉴定

为明确Pi9和Pi-ta 2个稻瘟病抗性主效基因在黄淮稻区种植水稻品种中的分布状况,利用分子标记对60个水稻品种进行Pi9和Pi-ta抗稻瘟病基因的分子鉴定。结果表明,60个检测品种中31个含有Pi9抗性基因,9个含有Pi-ta抗性基因,郑稻18、豫农粳12号、豫稻16、泰香2号、武香粳14号和武运粳21号等6个品种携带2个抗病基因。黄淮稻区水稻育种Pi9基因利用广泛,Pi-ta基因利用较少,今后应加强Pi-ta及更多主效广谱抗稻瘟病基因的聚合利用。

持有Pi9基因的水稻单基因系IRBL9-W对稻瘟病菌苗期和成株期抗性差异

【目的】Pi9是一个广谱稻瘟病抗性基因,田间病圃监测发现持有Pi9的水稻单基因系IRBL9-W在苗期高抗稻瘟病,但却感穗瘟。探明水稻单基因系IRBL9-W在苗期抗病而孕穗末期感染穗颈瘟的原因,为Pi9基因在水稻抗病育种中的有效利用提供参考。【方法】利用从IRBL9-W穗颈瘟病斑上分离的8个单孢菌株以及实验室保存的单孢菌株Y363,在温室分别对单基因系IRBL9-W苗期和孕穗末期进行接种鉴定;并利用病原菌AvrPi9基因的特异引物对9个单孢菌株进行PCR扩增及产物测序;提取水稻单基因系IRBL9-W苗期叶片和抽穗期穗部的总RNA,通过半定量RT-PCR以及实时qRT-PCR分析Pi9基因在苗期和穗期的表达。【结果】在温室人工喷雾接种条件下,IRBL9-W在苗期对从穗颈瘟上分离的8个单孢及对照菌株Y363均表现为抗病;随机选取的2个从IRBL9-W穗颈瘟病样分离的单孢菌株(YX2-7-1和YX2-15-1)及对照菌株Y363对孕穗末期IRBL9-W注射接种,接种的植株表现出典型的穗颈瘟症状;AvrPi9的等位基因分析结果表明,与AvrPi9相比,Y363中的等位基因与AvrPi9完全相同,而从IRBL9-W穗瘟分离的8个单孢菌株中编码区与AvrPi9基因完全相同,但在编码起始位置上游−264 bp处缺失16 bp的一段序列。由于IRBL9-W苗期对这些菌株均表现抗病,推测这段序列的缺失并不影响AvrPi9基因的功能;实时qRT-PCR分析结果表明,Pi9基因在穗部的表达量为苗期叶片表达量的47.3%。【结论】在水稻单基因系IRBL9-W中,与苗期叶片中Pi9基因的表达量相比,Pi9基因在穗部表达量的明显降低可能是造成IRBL9-W穗期感稻瘟病的原因。

稻瘟菌T-DNA插入所致Pi9致病突变体的获得

利用自建稻瘟菌菌株FJ95054B T-DNA插入突变体库,筛选获得2个对水稻品种P i9致病的突变体P i9-2-8T940017401和P i9-1-2 T940032801.以T-DNA侧翼序列为探针筛选该菌株的BAC文库,得到阳性BAC克隆.