致病疫霉NLP家族基因PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化

为了制备致病疫霉NLP家族中PiNLP30蛋白的多克隆抗体,根据GenBank中PiNLP30的cDNA序列及原核表达载体pET28b中的多克隆位点设计引物,对PiNLP30基因进行RT-PCR扩增和重组质粒pET28b-PiNLP30的构建,将重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)表达体系中进行诱导表达,通过SDS-PAGE检测蛋白质表达,并利用镍琼脂糖亲和层析进行蛋白质纯化。克隆和序列分析显示,该基因cDNA全长714bp,编码237个氨基酸。该基因编码蛋白质是一个主要由不规则卷曲组成的亲水蛋白,含有一段19个氨基酸的信号肽序列。预测蛋白质分子量为26.6kD,等电点5.49。经PCR、酶切及测序验证,成功构建了原核表达载体pET28b-PiNLP30,使用0.6mmol/L IPTG于37℃下诱导6h后蛋白质大量表达,表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。经镍琼脂糖亲和层析进行纯化,获得了纯化的PiNLP30蛋白,其质量浓度约为0.3mg/mL。