Pib启动子中茉莉酸和乙烯响应元件的转基因分析

水稻Pib基因的表达受茉莉酸、乙烯等激素诱导,为了确定该基因启动子响应茉莉酸和乙烯诱导的必需区域,进一步阐明茉莉酸和乙烯响应分子元件,文章用PCR制备了Pib全长启动子-3572～2bp及3个5′端有不同长度缺失的Pib启动子片段-2692～2bp、-1335～2bp、-761～2bp。4个不同长度Pib启动子分别置换掉双元质粒中gus基因上游的35S构建为重组质粒,经农杆菌介导转入水稻获得转基因植株。转基因水稻中gus活性的蛋白质水平和mRNA水平的定性和定量分析结果表明,全长Pib启动子(-3572～2bp,pNAR901)启动活性最强,茉莉酸或乙烯诱导6h后,其驱动gus基因在转基因植株各部组织中的表达量明显上升。而-3572～-2692bp区段序列缺失后不但Pib启动子启动活性显著降低而且也丧失了对茉莉酸和乙烯的诱导活性。pNAR902(-2692～2bp),pNAR903(-1335～2bp)和pNAR904(-761～2bp)中的Pib启动子序列的缺失长度相差达2倍和3倍以上,但其对茉莉酸和乙烯的诱导响应没有区别。这些结果显示3个Pib启动子缺失体构建中,其共同缺失序列即-3572～-2692bp区域是Pib启动子茉莉酸和乙烯诱导响应的必需区域。软件检索证实,Pib启动子序列中只在上述共同缺失区段之内的-2722bp处有一个GCCGCC基序。文章报道的转基因实验表明GCCGCC基序可能是Pib基因中有关茉莉酸和乙烯诱导响应的顺式分子元件。

pib基因启动子及其诱导启动性初探

将pib基因上游5.7 kb区段取代pCAMBIA1301中gus基因上游的35S启动子,构建了pib拟启动区-GUS+35S-hpt植物表达载体pNAR604。经农杆菌介导转化水稻成熟胚愈伤,获得了转基因抗潮霉素愈伤和36株转基因水稻植株。转基因抗性愈伤和转基因植株根的组织化学GUS活性检测表明,光照培养下的抗性愈伤和转基因植株根不能使X-gluc显色,而暗处理24 h后的抗性愈伤和定植后转基因植株的根能使X-gluc显色。转基因植株GUS荧光定量分析结果表明,GUS表达具有器官特异性,黑暗处理前根的GUS活性最高、茎次之,分别是叶片的7倍和3倍,叶片中仅有痕量本底。24 h黑暗处理后根、茎、叶中GUS活性都有增加,且叶片中的增加比例最大,其活性仅次于根。5 mmol/L水杨酸和0.3 mol/L NaCl叶面喷施转基因植株24 h后叶片中GUS活性分别为处理前的2.7和3.6倍。初步确定pib拟启动区是一个诱导型启动子。黑暗、水杨酸和NaCl能诱导该启动子启动活性。