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人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达
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作者 王忠泽 王慧 荫俊 《生命科学研究》 CAS CSCD 2002年第S1期90-93,共4页
采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白(osteogenic protein-1,OP-1)成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从构建的含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段... 采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白(osteogenic protein-1,OP-1)成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从构建的含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞,经鉴定的阳性重组质粒并线形化,电转化毕氏酵母细胞GS115,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,表达产物存在于培养基中,占分泌蛋白的10%.重组表达产物进行Western Blot可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性. 展开更多
关键词 人成骨蛋白 成熟肽 基因克隆 基因表达 毕氏酵母
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Optimization of Media for Production of an Effective Yeast Biocontrol Agent Pichia membranefaciens 被引量:1
2
作者 WANYa-kun TIANShi-ping 《Agricultural Sciences in China》 CAS CSCD 2004年第4期286-291,共6页
The growth of Pichia membranefaciens was studied using different nitrogen and carbonsources as substrates. Among nitrogen sources tested, soya peptone, yeast extract power,beef extract and polypeptone were relatively ... The growth of Pichia membranefaciens was studied using different nitrogen and carbonsources as substrates. Among nitrogen sources tested, soya peptone, yeast extract power,beef extract and polypeptone were relatively favorable to the growth of yeast. Thedensity of the yeast showed to be directly proportional to carbon sources supplementation.Glucose and fructose were good carbon sources for the yeast growth. However, lactoseshowed poor performance for the cell growth of the yeast. In this study, beef extractpresented a good synergic effect on the yeast growth with different carbonhydrates. Themedium for P.membranefaciens used glucose and beef extract as substrates. The higherconcentration of glucose and beef extract, the better growth of P.membranefaciens. Theaddition of chlorella growth factor (CGF) stimulated markedly the growth of P.membranefaci-ens.The increased concentration of CGF from 0.5 to 1% did not enhance the numbers ofP.membranefaciens. This result will help design a better strategy for scale-up produc-tion of P.membranefaciens. 展开更多
关键词 pichia membranefaciens Antagonistic yeast MEDIA OPTIMIZATION
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猪白细胞介素-6在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达 被引量:2
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作者 严琳 顾贫 陈焕春 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期387-391,共5页
白细胞介素6 (Interleukin_6 ,IL_6 )是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在疾病诊断与疫苗佐剂领域有广阔的应用前景。在本试验中,猪白细胞介素_6 (pIL_6 )的cDNA序列被克隆入甲醇酵母(Pichiapastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入P... 白细胞介素6 (Interleukin_6 ,IL_6 )是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在疾病诊断与疫苗佐剂领域有广阔的应用前景。在本试验中,猪白细胞介素_6 (pIL_6 )的cDNA序列被克隆入甲醇酵母(Pichiapastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入P .pastorisGS115菌株。其重组菌株GS115 pPIC9K_IL6经1%甲醇诱导后,能分泌表达分子量约为2 4 5KD的重组蛋白,Westernblot确证为pIL_6。该酵母表达产物无N端糖基化修饰。用依赖IL6生长的B9细胞株检测提纯后的pIL_6 ,其生物学活性可达8×10 4 IU mg。 展开更多
关键词 猪白细胞介素6 pichia PASTORIS 酵母表达 生物学活性
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基因工程菌Pichia pastoris连续培养的生长及抑制动力学 被引量:7
4
作者 吴康华 郭美锦 +2 位作者 庄英萍 储炬 张嗣良 《华东理工大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期605-609,共5页
在同一稀释率μ(μ=0 .1 4h-1)下用不同浓度的甘油流加进行连续培养 ,研究甘油浓度对基因工程菌毕赤酵母 ( Pichia pastori)生长的影响。结果表明甘油浓度对细胞生物量 ( DCW和WCW)、底物得率系数 ( YX/ S)、底物比消耗速率 ( qs)、呼吸... 在同一稀释率μ(μ=0 .1 4h-1)下用不同浓度的甘油流加进行连续培养 ,研究甘油浓度对基因工程菌毕赤酵母 ( Pichia pastori)生长的影响。结果表明甘油浓度对细胞生物量 ( DCW和WCW)、底物得率系数 ( YX/ S)、底物比消耗速率 ( qs)、呼吸熵 ( RQ)与二氧化碳释放率 ( CER)都有影响 ,在低甘油残留浓度 ( <63.3g/L)下 ,甘油是激活剂 ,菌体生长符合 Monod方程 ,Ks=1 9.62 g/L,甘油激活常数 Ka=1 9.45 g/L;而在高甘油残留浓度 ( >63.3g/L )下甘油是抑制剂 ,菌体生长特征符合 Haldance方程 ,Ks=0 .0 1 4g/L,KI=1 5 6.67g/L。毕赤酵母生长的甘油抑制浓度为 5 5 .42 展开更多
关键词 基因工程菌 毕赤酵母 连续培养 生长动力学 重组人血清白蛋白 抑制动力学 甘油浓度
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人胰岛素原在甲醇酵母(Pichia pastoris)中的高效表达 被引量:13
5
作者 郭永志 沈孝宙 《生物工程进展》 CSCD 1999年第6期64-67,共4页
甲醇营养型酵母Pichia pastoris在近十几年已被人们广泛用作外源基因表达的系统。表达的是可溶性蛋白,且胞外分泌。本研究系将外源基因(胰岛素原基因)连接到穿梭质粒PHIL-S1上,再通过同源重组到酵母染色体,... 甲醇营养型酵母Pichia pastoris在近十几年已被人们广泛用作外源基因表达的系统。表达的是可溶性蛋白,且胞外分泌。本研究系将外源基因(胰岛素原基因)连接到穿梭质粒PHIL-S1上,再通过同源重组到酵母染色体,筛选表达株。用1 升发酵罐在甲醇诱导下可获得0. 展开更多
关键词 甲醇酵母 营养型酵母 基因表达系统 胰岛素原
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产香酵母Pichia myanmarensis LX15的分离纯化及对精酿啤酒风味物质形成的影响 被引量:13
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作者 王伟 俞志敏 +2 位作者 侯英敏 堵国成 李宪臻 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2018年第4期34-40,共7页
为了适应精酿啤酒对个性化风味的需求,能产生特定风味化合物的产香酵母成为研究者的研究重点。从精酿啤酒原液中分离到1株产香酵母LX15菌,该菌细胞呈圆形或卵圆形、多极芽殖生长;LX15菌在玉米粉培养基上培养7~10 d不形成假菌丝,在酵母... 为了适应精酿啤酒对个性化风味的需求,能产生特定风味化合物的产香酵母成为研究者的研究重点。从精酿啤酒原液中分离到1株产香酵母LX15菌,该菌细胞呈圆形或卵圆形、多极芽殖生长;LX15菌在玉米粉培养基上培养7~10 d不形成假菌丝,在酵母膏蛋白胨培养基上培养3 d能够形成子囊孢子。经生理生化特征和系统发育分析,确认该生香酵母为Pichia myanmarensis菌中的一个菌株,所产主要风味化合物包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯。当LX15菌与啤酒酵母C1菌共发酵时,能够产生协同效应,提高酯类化合物和高级醇类的含量,并与LX15菌的接种比例正相关,但并不影响啤酒酿造的整体发酵速率和发酵能力。因此,LX15菌是一株适于提高精酿啤酒风味的产香酵母菌。 展开更多
关键词 精酿啤酒 产香酵母 筛选 风味物质 pichia myanmarensis
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兔Oddi氏括约肌细胞BK通道Alpha亚基在Pichia酵母中的高效表达、纯化和鉴定
7
作者 王亚蓉 魏经国 +3 位作者 樊建勇 沈柱 王秦芳 张孝勇 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期212-215,共4页
目的用巴斯德毕赤酵母系统表达兔Oddi氏括约肌(SO)细胞BK通道α亚基,并进行纯化和鉴定。方法采用RTPCR扩增编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,经测序正确将其克隆入酵母表达载体pPIC9K,以电穿孔法转化酵母GS115。经MD平板... 目的用巴斯德毕赤酵母系统表达兔Oddi氏括约肌(SO)细胞BK通道α亚基,并进行纯化和鉴定。方法采用RTPCR扩增编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,经测序正确将其克隆入酵母表达载体pPIC9K,以电穿孔法转化酵母GS115。经MD平板筛选重组子、G418筛选鉴定后,甲醇诱导表达,镍离子亲合层析法对表达上清进行纯化,进行SDSPAGE和免疫印迹分析。结果用RTPCR扩增出约1497bp的兔SO细胞BK通道α亚基基因的cDNA。序列分析显示,扩增序列与已发布的新西兰大白兔骨骼肌BK通道α亚基的cDNA序列完全一致。SDSPAGE显示本系统表达的α亚基融合蛋白Mr约为55000,表达量约为55mg/L,纯度为96%。Westernblot检测证明,该α亚基融合蛋白可与兔BK通道α亚基多克隆抗体特异性结合。结论克隆了编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,并在毕赤酵母中成功地表达了该蛋白,为进一步研究BK通道提供了物质基础。 展开更多
关键词 pichia酵母 BK通道Alpha亚基 分泌表达
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克鲁维毕赤酵母与酿酒酵母顺序接种对茵红李果酒风味的影响
8
作者 李甜 邓孟胜 +3 位作者 雷雨 陶迎梅 李宇豪 李东 《现代食品科技》 CAS 北大核心 2024年第8期283-293,共11页
为提高茵红李果酒的风味品质,选用克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行顺序接种,接种时间间隔分为24 h和48 h,接种比例为1:3、3:1和1:1。通过测定酵母生物量变化、理化指标、挥发性风味成分和感... 为提高茵红李果酒的风味品质,选用克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行顺序接种,接种时间间隔分为24 h和48 h,接种比例为1:3、3:1和1:1。通过测定酵母生物量变化、理化指标、挥发性风味成分和感官分析,探究不同接种策略对茵红李果酒风味的影响。结果显示,在混菌发酵中,两种酵母相互制约,6~7 d后未检测到P.kluyveri的活菌存在。此外,与间隔24 h相比,间隔48 h接种发酵的茵红李果酒中乙醇含量较低,而还原糖含量较高。与对照纯酿酒酵母相比,混合发酵使茵红李果酒中酯类化合物浓度增加了33.37%~56.96%,高级醇类减少了47.23%~60.69%。其中T481:3和T243:1接种方式的酯类化合物含量增加最为显著。主成分分析揭示T243:1与苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异丁酯、乙酸顺式-3-己烯酯和葵酸乙酯密切相关。感官评价显示,T243:1发酵的茵红李果酒在花果香和整体可接受性方面的评分最高。综上所述,T243:1接种方式有助于提升茵红李果酒的风味品质,为茵红李果酒生产工艺的优化提供了理论参考。 展开更多
关键词 克鲁维毕赤酵母 顺序发酵 酵母生物量变化 茵红李果酒 风味成分
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人肝细胞生长因子cDNA的克隆及其在Pichia系统中的表达 被引量:1
9
作者 李孝圭 顾银良 +1 位作者 朱运松 宋后燕 《药物生物技术》 CAS CSCD 1997年第4期193-197,共5页
采用 RT- PCR方法以胎肝 m RNA为模板克隆人肝细胞生长因子全长 c DNA,核苷酸序列分析证实比文献报道多 2个氨基酸编码序列。经与 Pichia分泌型表达载体 p PIC9重组 ,表达质粒转化 GS115细胞 ,mut+ 表型筛选 ,经甲醇诱导实现了 h HGF在 ... 采用 RT- PCR方法以胎肝 m RNA为模板克隆人肝细胞生长因子全长 c DNA,核苷酸序列分析证实比文献报道多 2个氨基酸编码序列。经与 Pichia分泌型表达载体 p PIC9重组 ,表达质粒转化 GS115细胞 ,mut+ 表型筛选 ,经甲醇诱导实现了 h HGF在 Pichia Pastoris酵母系统中分泌型表达 ,SDS- PAGE电泳 ,银染法分析证实表达产物分子量为 80~ 85KD左右 ,具有刺激肝细胞增殖活性。 展开更多
关键词 肝细胞生长因子 CDNA DNA克隆 pichia 酵母
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胰岛素原基因的高效分泌表达系统——甲醇酵母Pichia pastoris 被引量:1
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作者 吴颖 钱凯先 《浙江大学学报(工学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第7期1091-1095,共5页
为了提高重组人胰岛素的表达效率,使用了近年发展起来的真核表达系统-甲醇酵母Pichia pastoris. Pichia pastoris以甲醇为其惟一碳源,而乙醇氧化酶基因的启动子是强启动子,可用来调控异源蛋白的表达.该系统具有操作技术简单,可进行高水... 为了提高重组人胰岛素的表达效率,使用了近年发展起来的真核表达系统-甲醇酵母Pichia pastoris. Pichia pastoris以甲醇为其惟一碳源,而乙醇氧化酶基因的启动子是强启动子,可用来调控异源蛋白的表达.该系统具有操作技术简单,可进行高水平的胞内或胞外表达,及对表达产物进行翻译后修饰与加工等显著优点.将含有小C肽或不含有C肽的人胰岛素原类似物基因整合到酵母基因组上来发酵生产人胰岛素原,在表达量上,每升发酵液中可以得到胰岛素原250~300mg,分泌水平约占总蛋白量的20%,重组人胰岛素具有与猪胰岛素相同的受体结合能力和生物活性. 展开更多
关键词 胰岛素原 甲醇酵母 pichia PASTORIS 乙醇氧化酶(AOX) 表达系统
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Pichia pastoris细胞的酶法水解
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作者 张永杰 牛丹丹 +5 位作者 吴海洋 黄磊 董自星 刘晓光 叶秀云 路福平 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期80-84,90,共6页
以工业酶制剂生产中的废弃毕赤酵母细胞为对象,研究并建立了酶法制备酵母浸出物的新工艺。新工艺为:10%(w/v)废弃毕赤酵母菌体中加入β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶,于50℃作用12 h;再加入中性蛋白酶,于50℃作用7 h;再加入DNA酶和... 以工业酶制剂生产中的废弃毕赤酵母细胞为对象,研究并建立了酶法制备酵母浸出物的新工艺。新工艺为:10%(w/v)废弃毕赤酵母菌体中加入β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶,于50℃作用12 h;再加入中性蛋白酶,于50℃作用7 h;再加入DNA酶和RNA酶,于37℃作用4 h。离心收集上清液,真空冷冻(或喷雾)干燥获得酵母浸出物。运用这一技术,酵母细胞组分的溶出率达到66.2%,固形物收得率为65.7%。使用该研究制得的酵母浸出物培养重要工业微生物菌种,其支撑细胞生长繁殖的效果显著优于市售酵母粉。 展开更多
关键词 酵母浸出物 酶法制备 毕赤酵母
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Isolation of aromatic yeasts(non-<i>Saccharomyces</i><i>cerevisiae</i>) from Korean traditional <i>nuruks</i>and identification of fermentation characteristics 被引量:1
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作者 Choi Ji Ho Soo Hwan Yeo +5 位作者 Ji-Hye Park Han Seok Choi Ji-Eun Gang Soo In Kim Seok Tae Jeong So Ra Kim 《Agricultural Sciences》 2013年第5期136-140,共5页
Ethyl caproate and isoamyl alcohol are important for the quality of Yakju, one of the Korean traditional alcoholic beverages. From Korean traditional fermentation agent, Nuruk, we have isolated 8 yeasts which produced... Ethyl caproate and isoamyl alcohol are important for the quality of Yakju, one of the Korean traditional alcoholic beverages. From Korean traditional fermentation agent, Nuruk, we have isolated 8 yeasts which produced rich aromatic compounds using YEPD agar plates (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 2% agar) containing 50 uL cerulenin at 30℃. The isolated aromatic yeasts are identified as Pichia anomala (4 strains), Pichia fabianii (2 strains), Pichia farinose (1 strains), Geotrichum candidum (1 strains). We conducted alcohol fermentation with each of the aromatic yeasts and the compounds (ethyl caproate and isoamyl alcohol) producing range were 59.5 - 193.2 ppm and 10.8 - 91.6 ppm respectively. As a control, Fermivin&reg;, famous aromatic wine yeast, was 89.4 ppm and 16.2 ppm respectively. We also find that the isolated Pichia anomala could produce higher level ethanol (4.2% - 5.0%, v/v) than other species (0.4% - 2.2%, v/v). Using the aromatic yeasts in fermentation industries, we expect to improve the quality of traditional alcoholic beverages. 展开更多
关键词 AROMATIC yeast pichia sp. Yakju KOREAN TRADITIONAL Alcoholic Beverage Ethyl Caproate
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Ethanol Production from Cassava Pulp by a Newly Isolated Thermotolerant <i>Pichia kudriavzevii</i>LC375240
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作者 Ifeanyi A. Ndubuisi Julius E. Nweze +2 位作者 Nnaemeka J. Onoyima Murata Yoshinori James C. Ogbonna 《Energy and Power Engineering》 2018年第10期457-474,共18页
A total of 500 thermotolerant fermenting yeast isolates (100 from palm-wine and 400 from spoilt fruits) were screened for ethanol production at high temperatures. The best isolate that produced up to 4% ethanol from 1... A total of 500 thermotolerant fermenting yeast isolates (100 from palm-wine and 400 from spoilt fruits) were screened for ethanol production at high temperatures. The best isolate that produced up to 4% ethanol from 10% glucose at 45°C was selected for further experiments. The optimum pH for ethanol production by the isolate was pH 6 at both 30°C and 42°C. The isolate was identified as Pichia kudriavzevii base on the 18s ribosomal DNA. Ethanol production from 200 g/L cassava pulp using Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) method at 30°C and 42°C by the isolate was investigated. At 30°C, an ethanol concentration of 30 g/L was produced. This represents an ethanol yield of 0.15 g/g of cassava pulp and 58.8% of the theoretical yield. However at 42°C, the concentration of ethanol produced increased to 42 g/L representing an ethanol yield of 0.21 g/g of cassava pulp and 82.4% of the theoretical yield. The isolate produced slightly higher ethanol than the two typed strains NCYC 587 and NCYC 2791 at 42°C. This isolate has a good potential to be used for commercial bioethanol production since it can produce ethanol at 45°C without a significant drop in ethanol yield. 展开更多
关键词 Bioethanol CASSAVA PULP yeast THERMOTOLERANT pichia kudriavzevii
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毕赤酵母水解工艺的研究
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作者 袁稚雯 王士岩 +1 位作者 朱小燕 李相前 《工业微生物》 CAS 2023年第5期92-96,共5页
在发酵过程中产生的总体积为30%~40%的毕赤酵母菌体,大部分在发酵后,会直接把酵母菌体排入环境中,不仅浪费资源,还污染环境,因此,实现资源再利用是文章的研究目的。最终结果表明,对毕赤酵母自溶破壁的最佳自溶水解条件为50℃、pH 6.0,... 在发酵过程中产生的总体积为30%~40%的毕赤酵母菌体,大部分在发酵后,会直接把酵母菌体排入环境中,不仅浪费资源,还污染环境,因此,实现资源再利用是文章的研究目的。最终结果表明,对毕赤酵母自溶破壁的最佳自溶水解条件为50℃、pH 6.0,作用时间为30 h、4%Na Cl,酵母悬浮液终体积分数为10%。此外,通过对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶进行研究发现,添加木瓜蛋白酶效果最佳,添加后的酵母水解物氨基氮得率为4.5%,固形物得率为59%,粗蛋白含量为45.38%。 展开更多
关键词 毕赤酵母 酵母水解物 水解工艺 蛋白酶
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季也蒙毕赤酵母MCJ-1培养条件优化及其冻干菌粉的制备
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作者 王爱灵 冯子娟 +2 位作者 吴君海 雷青青 吴鑫颖 《中国酿造》 CAS 北大核心 2023年第5期78-84,共7页
康普茶是一种酸甜味发酵饮料,由酵母、糖和发酵茶制成。该研究以从康普茶混菌体系中筛选获得的季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)MCJ-1为研究对象,采用单因素试验及响应面法优化菌株MCJ-1的培养条件,并制备其冻干菌粉。结果表明,菌... 康普茶是一种酸甜味发酵饮料,由酵母、糖和发酵茶制成。该研究以从康普茶混菌体系中筛选获得的季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)MCJ-1为研究对象,采用单因素试验及响应面法优化菌株MCJ-1的培养条件,并制备其冻干菌粉。结果表明,菌株MCJ-1的最佳培养条件为:蔗糖25.00 g/L,氯化铵7.7 g/L,蛋白胨10.00 g/L,酵母浸粉5.00 g/L,培养温度30℃,初始pH值为6,转速200 r/min。在此优化培养条件下,菌体干质量为(5.06±0.22)mg/mL,比优化前提高了64.82%。菌粉制备中菌泥与保护剂的比例为1:1,保护剂甘油添加量为4.0%,可以获得存活率达(80.83±5.36)%的冻干菌粉。 展开更多
关键词 康普茶 季也蒙毕赤酵母MCJ-1 培养条件 响应面优化 冻干菌粉 制备
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鸡白细胞介素2在毕赤酵母细胞中的表达 被引量:11
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作者 许健 樊拥军 +3 位作者 李龙 万旺军 李建荣 于涟 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期339-342,共4页
目的 利用Pichia酵母真核细胞表达系统表达重组鸡白细胞介素 2 (IL 2 ) ,为大量制备鸡IL 2奠定基础。方法 将ConA激活的鸡脾脏T淋巴细胞中扩增得到的我国地方品种萧山鸡IL 2基因 ,克隆入pPIC9载体中构建重组质粒。将重组质粒电转化毕... 目的 利用Pichia酵母真核细胞表达系统表达重组鸡白细胞介素 2 (IL 2 ) ,为大量制备鸡IL 2奠定基础。方法 将ConA激活的鸡脾脏T淋巴细胞中扩增得到的我国地方品种萧山鸡IL 2基因 ,克隆入pPIC9载体中构建重组质粒。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115感受态细胞 ,甲醇诱导蛋白质表达。结果 SDS PAGE和Westernblot均在 30ku处检测到特异条带。结论 表明重组鸡IL 展开更多
关键词 鸡IL-2 pPIC9 毕赤酵母 免疫增强剂
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纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 被引量:14
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作者 罗立新 黄志立 +2 位作者 潘力 杨汝德 梁世中 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2003年第2期1-4,共4页
构建pPICZαA-NK重组质粒,并转化入E-coli TOP-10中,得到转纳豆激酶基因工程菌,提取重组质粒经单酶切、双酶切、PCR分析及序列测定,证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因.将重组质粒pPICZαA-NK线性化后,分别转化毕赤酵... 构建pPICZαA-NK重组质粒,并转化入E-coli TOP-10中,得到转纳豆激酶基因工程菌,提取重组质粒经单酶切、双酶切、PCR分析及序列测定,证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因.将重组质粒pPICZαA-NK线性化后,分别转化毕赤酵母GS115与KM71,在含ZeocinTM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母.经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性,SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右. 展开更多
关键词 巴斯德毕赤酵母 纳豆激酶基因 基因表达 基因工程 溶纤活性 基因克隆 重组质粒
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猪白细胞介素-2在甲醇酵母中的表达 被引量:10
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作者 严琳 陈焕春 +2 位作者 覃雅丽 何启盖 肖少波 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期208-212,共5页
将猪白细胞介素-2(pIL-2)的完整cDNA序列克隆到甲醇酵母(Pichiapastoris)表达载体pPIC3 5K中,在E.coli体系中鉴定得到阳性克隆子pPIC3 5K-IL2。将pPIC3 5K-IL2经SacI线性化后,转化入经LiC1致敏的P.PastorisGS115菌株中,得到的重组菌株... 将猪白细胞介素-2(pIL-2)的完整cDNA序列克隆到甲醇酵母(Pichiapastoris)表达载体pPIC3 5K中,在E.coli体系中鉴定得到阳性克隆子pPIC3 5K-IL2。将pPIC3 5K-IL2经SacI线性化后,转化入经LiC1致敏的P.PastorisGS115菌株中,得到的重组菌株经1%浓度甲醇诱导后,利用SDS-PAGE电泳,斑点杂交及去糖基化酶消化证实,在培养上清中获得了分泌型表达的猪白细胞介素-2(蛋白分子量约为20KD),其表达量可达到80mg/L。用CTLL-2细胞进行活性检测,生物学活性可达2×106IU/ml。对其表达情况进行时间梯度分析,确定第5天表达量达到最高点,为最佳诱导时间;分析连续4个批次的重组菌株表达情况,结果表明重组菌株在适当菌体浓度下连续培养均能稳定、高效的表达外源蛋白pIL-2。本实验为进一步大规模生产pIL-2提供了理论依据。 展开更多
关键词 白细胞介素-2 甲醇酵母 基因表达 阳性克隆子
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VEGF受体KDR克隆及其对内皮细胞增殖和血管新生的影响 被引量:3
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作者 周彩存 谈立松 +3 位作者 唐亮 张颉 粟波 康健 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2001年第3期173-177,共5页
目的 :克隆VEGF受体KDR基因膜外 5 7区 ,探讨其生物学活性。方法 :提取脐静脉血管内皮细胞总RNA ,克隆KDR基因膜外部分 5 7区 ,并使之在QIA表达系统进行表达 ;镍柱亲和层析纯化、复性、生物学活性鉴定。结果 :该系统能表达KDR基因片... 目的 :克隆VEGF受体KDR基因膜外 5 7区 ,探讨其生物学活性。方法 :提取脐静脉血管内皮细胞总RNA ,克隆KDR基因膜外部分 5 7区 ,并使之在QIA表达系统进行表达 ;镍柱亲和层析纯化、复性、生物学活性鉴定。结果 :该系统能表达KDR基因片段 ,表达量约占菌体蛋白总量的 5 %左右。经复性 ,可溶性蛋白具有与VEGF特异结合功能 ,并能抑制VEGF促使脐静脉内皮细胞增殖和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用。结论 :KDR基因片段能在QIA表达系统中得到表达 ,复性后表达蛋白具有与VEGF结合的生物学功能。 展开更多
关键词 血管内皮细胞生长因子 可溶性受体 KDR 原核表达 pichia酵母 血管新生 内皮细胞增殖 肿瘤
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牛乳溶菌酶在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析 被引量:3
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作者 付世新 齐长学 +2 位作者 罗春海 张丽 王瑶 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期428-431,454,共5页
为真核表达牛乳溶菌酶,本研究在通过酵母偏爱密码子改造并人工合成LYZ1基因的基础上,将LYZ1基因经克隆构建了高效表达具有生物活性牛乳溶菌酶的分泌型表达载体pPICZα-A-LYZ1,将其经SacⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母菌株GS115中,通过Zeo... 为真核表达牛乳溶菌酶,本研究在通过酵母偏爱密码子改造并人工合成LYZ1基因的基础上,将LYZ1基因经克隆构建了高效表达具有生物活性牛乳溶菌酶的分泌型表达载体pPICZα-A-LYZ1,将其经SacⅠ酶切线性化后电转化毕赤酵母菌株GS115中,通过Zeocin筛选和PCR鉴定后的阳性重组菌用甲醇诱导60h后,进行SDS-PAGE和western blot鉴定,用溶壁微球菌对其进行活性检测,并对其进行体外抑菌效果检测分析。结果表明:分泌表达的重组目的蛋白约16ku,而且抗血清具有良好的反应原性。活性检测表明,培养液中重组溶菌酶活性达到2842u/mL。体外抑菌试验结果表明,重组牛乳溶菌酶对标准葡萄球菌及大肠杆菌菌株具有较好的抗菌作用,而对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌作用较弱。 展开更多
关键词 牛乳溶菌酶 毕赤酵母 分泌表达 抗菌活性
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