Pim-3基因表达下调及其对食管鳞癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究Pim-3基因的表达下调及其对食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:利用Pim-3siRNA转染食管鳞癌EC970细胞,并利用RT-PCR和Westernblot技术检测转染Pim-3siRNA后食管鳞癌EC9706细胞中Pim-3的表达.此外,利用CCK-8试剂盒和流式细胞术分别研究下调Pim-3基因的表达对EC9706细胞增殖和凋亡的影响,进一步利用RT-PCR和Westernblot检测与增殖相关的P2基因,与凋亡相关的Bcl-2、Bax基因的表达.结果:转染Pim-3后,Pim-3基因在食管鳞癌EC9706细胞中的表达明显下调(P<0.05).与未处理组和对照siRNA组相比,Pim-3siRNA组在转染24、48、72、96hEC9706细胞的增殖均明显受到抑制(96h:0.878±0.061vs2.25±0.062,2.219±0.064,均P<0.05).转染48h后Pim-3siRNA组细胞早期凋亡率为19.70%±1.46%,显著高于未处理组和对照siRNA组的早期凋亡率(5.35%±0.80%,5.50%±0.61%,F=195.692,P=0.000).此外,Pim-3表达的下调能引起P21和Bax基因表达的升高(均P<0.05)Bcl-2基因表达的下调(P<0.05).结论:Pim-3可能在食管鳞癌EC9706细胞的增殖和凋亡中发挥重要作用.

沉默pim-3基因对黑色素瘤细胞B16的抑制作用

目的:观察靶向沉默原癌基因pim-3对小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制作用。方法:用脂质体将特异性靶向沉默pim-3载体(pim-3-shRNA)和pim-3过表达载体(pim-3-MIGR1)转染到黑色素瘤细胞B16中,荧光定量PCR和Western blotting法检测pim-3 mRNA和蛋白表达的变化,Annexin V/PI染色和TUNEL染色检测细胞凋亡情况,荧光定量PCR和Western blotting法检测pBad、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、caspase-3等凋亡相关分子表达的变化,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期,RTCAxCELLigence系统检测细胞迁移情况,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭的变化。结果:转染pim-3-sh RNA组B16细胞的pim-3mRNA及蛋白表达较对照组明显下降(P<0.05),转染pim-3过表达质粒组B16细胞的pim-3 mRNA及蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05)。转染pim-3-shRNA后,B16细胞的凋亡明显增加,在此基础上共转pim-3过表达质粒后则明显逆转沉默pim-3所引起的凋亡(P<0.05);进一步检测发现沉默pim-3明显下调凋亡相关分子p-Bad、Bcl-2、Bcl-xl的表达,上调Bax的表达,最终引起caspase-3活性增加(P<0.05)。沉默pim-3后B16细胞增殖和迁移受到抑制(P<0.05),而细胞周期无明显变化。结论:靶向沉默pim-3基因能促进黑色素瘤细胞的凋亡,抑制细胞的增殖和迁移,提示pim-3基因可以作为黑色素瘤基因治疗的新靶点。

Pim-3基因在急性髓系白血病中的表达及意义

目的:探讨Pim-3基因的异常表达在急性髓系白血病发展过程中的作用。方法:使用半定量RT-PCR法检测47例初诊未经治疗的急性白血病患者骨髓及18例经化疗治疗后急性白血病患者骨髓标本Pim-3基因的表达,同时采集非恶性血液病患者骨髓组织10例作为正常对照组,比较3组骨髓组织Pim-3基因表达量的差异。结果:RT-PCR检测结果显示,化疗前急性髓系白血病患者骨髓Pim-3基因表达量相对非恶性血液病骨髓表达量明显降低(P<0.01)。经化疗治疗后的骨髓Pim-3基因表达量与非恶性血液病骨髓表达量无明显差异(P>0.05),而化疗前急性髓系白血病患者骨髓Pim-3基因表达量明显低于化疗后急性髓系白血病患者(P<0.01)。缓解组急性髓系白血病患者化疗前后对比显示,化疗前比化疗后骨髓Pim-3基因表达量明显降低(P<0.01),而未缓解组中急性髓细胞白血病(AML)患者化疗前与化疗后骨髓组织Pim-3基因表达量无明显差异(P>0.05),化疗后未缓解的急性髓系白血病患者骨髓Pim-3基因表达量亦明显低于缓解后患者(P<0.01)。结论:Pim-3基因在化疗前后急性髓系白血病中有异常表达,该基因可能参与了急性髓系白血病的发生发展。

Pim-3基因抑制暴发性肝细胞凋亡的机制

目的探讨Pim-3基因对暴发性肝细胞凋亡的抑制机制。方法32只大鼠随机分成4组（8只／组）。A组为正常对照组，B、C组和D组采用流体力学注射方法，分别以林格氏液、空载体质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2／Pim-3溶液预处理大鼠；1d后，予脂多糖（LPS）／D-半乳糖胺（D-GaIN）腹腔注射诱导暴发性肝细胞凋亡。8h后处死大鼠，采集肝组织标本。用Caspase-3活性测定法检测细胞凋亡情况；RT-PCR检测肝组织诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、p53基因表达水平；Westernblot检测肝组织Bcl-2、Bax蛋白表达水平。组间数据比较采用非参数Kruskai-Wallis检验。结果LPS／D—GalN联合攻击造成了大鼠肝内Caspase-3活性显著增高，而D组Caspase-3活性较B组和C组均显著降低[（141．7±13．7）RFU比（508．1±32．0）、（493．5±33．1）RFU，P值均〈0．0.01）。LPS／D-GalN的应用也诱导了肝组织iNOSmRNA、p53mRNA、Bax蛋白表达，与B组和C组相比，D组iNOSmRNA和p53mRNA的表达水平显著降低（0．06±0．01比0．42±0．08、0．35±0．06；0．73±0．11比1．17±0．25、1．23±0．31，P值均〈0．01），而Bax蛋白表达水平差异无统计学意义（1．19±0．09比1．13±0．08、1．25±0．11，P〉0．05）；另外，D组肝内Bcl-2蛋白表达水平较A、B组和C组均显著升高（3．05±0．29比1．03±0．05、0．98±0．06、1．10±0．08，P值均〈0．01）。结论Pim-3基因通过对损伤基因和凋亡相关基因的影响抑制了暴发性肝细胞凋亡的发生。

原癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2／pim-3,观察他在真核细胞SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响．方法:利用TRIzol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA,并构建重组质粒pEGFP-N2／pim-3,转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株,酶切以及测序鉴定．将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况,并利用流式细胞术及MTT比色实验对转染细胞的生物学行为进行检测．结果:将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收,在DL 2000 Marker 1000 bp附近可见清晰条带,与实验设计符合;阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明,大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2／pim-3的构建成功;重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3．5％,质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10．7％,而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11．0％,重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0．05);倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-772 1细胞中的正常表达;MTT比色实验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡．结论:真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功;原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡．

人参皂苷Rg3对人胰腺癌细胞Pim-3及Bad凋亡蛋白表达的影响

背景与目的:人参皂苷Rg3是一种抗肿瘤中药单体,有研究表明人参皂苷Rg3对肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等肿瘤细胞的浸润具有明显抑制作用。本实验目的是研究人参皂苷Rg3对人胰腺癌细胞株PANC-1中原癌基因Pim-3及磷酸化Bad蛋白pBad(Ser112)、Bad(Ser136)表达的影响。方法:用浓度为0、10、20、40和80μmol/L的人参皂苷Rg3处理PANC-1细胞24h后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测人参皂苷Rg3对PANC-1细胞增殖的抑制作用;用倒置显微镜和流式细胞术观察人参皂苷Rg3对PANC-1细胞凋亡的诱导作用;用Western blot法检测经不同浓度人参皂苷Rg3处理后的PANC-1细胞中pim-3、Bad、pBad(Ser112)和pBad(Ser136)的表达;定向克隆Pim-3的发夹状寡核苷酸(shor thairpin RNA,shRNA)到真核表达载体形成重组质粒pSilencer 3.1-HINeo-Pim-3 shRNA,将重组质粒通过脂质体介导转染PANC-1细胞,采用Annexin V/PI流式细胞分析法检测转染后PANC-1细胞的凋亡,用Western blot法检测转染后PANC-1细胞的pim-3及pBad(Ser112)的表达。结果:10、20、40和80μmo1/L的人参皂苷Rg3对PANC-1细胞增殖的抑制率分别为20.2%、33.4%、52.8%、65.3%;经10～80μmol/L的人参皂苷Rg3处理后PANC-1细胞呈现明显的凋亡形态学改变,80μmol/L人参皂苷Rg3处理PANC-1细胞24h后,与正常对照组细胞凋亡率(3.3±2.1)%比较,处理组细胞凋亡率(12.2±1.3)%增加(P<0.05);人参皂苷Rg3处理PANC-1细胞24h后,Bad总蛋白表达没有明显变化。pim-3和pBad(Ser112)的表达均随人参皂苷Rg3浓度的增加而逐渐减弱。PANC-1细胞中pBad(Ser136)不表达;Pim-3 shRNA转染PANC-1细胞后,与正常对照组比较,转染组早期凋亡率和总凋亡率均增加[(11.5±3.7)%vs.(5.8±2.2)%,P<0.01;(20.8±2.6)%vs.(13.0±4.1)%,P<0.05],转染组pim-3及pBad(Ser112)表达均低于正常对照组。结论:人参皂苷Rg3可下调胰腺癌细胞PANC-1中Pim-3以及磷酸化Bad蛋白的表达,从而抑制PANC-1细胞增殖,诱导细胞凋亡。

p38 MAPK-Pim-3通路可能介导预处理对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:研究MAPK通路在原癌基因Pim-3抗心肌急性缺氧复氧损伤中的作用。方法:采用原代培养新生大鼠的心肌细胞,随机分为4组:正常对照组(control)、缺氧复氧组(A/R)、缺氧预适应组(APC+A/R)、阻断剂组。在缺氧预处理前分别用终浓度为10μmol/LSB203850(p38MAPK阻断剂)、U0126(ERK1/2阻断剂)、SP600125(SAPK/JNK阻断剂)与细胞孵育30min。实验结束后测定MAPKs通路中ERK1/2、JNK、p38MAPK磷酸化蛋白表达水平及Pim-3蛋白的表达水平,同时检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、四唑盐(MTT)比色试验测定细胞存活率、TUNEL法检测细胞凋亡。结果:SB203850、U0126、SP600125能分别取消由APC或A/R所诱导ERK1/2、JNK、p38MAPK的磷酸化水平的升高;由APC所诱导的Pim-3表达的升高在p38MAPK通路被阻断后明显下调(P<0.01),并且心肌细胞LDH值升高,细胞存活率则下降,心肌细胞的凋亡指数升高。结论:p38MAPK的激活可上调原癌基因Pim-3的表达,从而可能对心肌细胞起到保护作用。

Pim-3质粒构建体在大鼠活体肝组织的表达和活性的研究

目的构建大鼠 Pim-3绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒并观察其在活体肝组织的表达和活性。方法采用逆转录 PCR 的方法获取目的 cDNA,重组质粒经酶切鉴定和测序;大鼠活体基因肝靶向性转染通过尾静脉流体力学注射法完成,肝细胞凋亡的诱导采用腹腔内注射内毒素和 D-半乳糖胺(D-GalN)来实现。动物分为 A、B、C 和 D 组(即正常、对照、空质粒和重组质粒组,每组8只);肝组织 GFP 表达通过荧光显微镜、Pim-3表达通过逆转录(RT)-PCR 方法检测;肝细胞凋亡采用缺口末端标记技术(TUNEL)分析和半胱天冬酶-3活性检测。结果成功构建 GFP 表达质粒 pEGFP-N2/Pim-3;重组质粒和空质粒 DNA 通过流体力学注射法被成功转染入大鼠活体肝组织内;4组 Pim-3的相对表达水平分别为0.06±0.02、0、0、0.49±0.15。D 组与其他3组差异均有统计学意义(均 P<0.01);4组肝细胞的凋亡指数(AI)分别为:(3.1±0.7)%,(72.5±6.1)%、(69.8±5.7)%和(4.9±1.2)%;肝组织半胱天冬酶-3活性分别为(60±15)、(147±55)、(142±50)和(76±27)pmol·min^(-1)·mg^(-1),D 组与 B、C 两组间差异有统计学意义(均 P<0.01)。结论构建的重组体质粒 pEGFP-N2/Pim-3能在大鼠活体肝组织内有效表达,并发挥其对肝细胞凋亡的抑制效应。

Pim-3表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及其分子机制研究

目的:研究Pim-3表达下调对舌鳞状细胞癌细胞凋亡的影响,并探讨其凋亡的相关分子机制。方法:将Pim-3siRNA和对照siRNA分别转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,另设未处理组。利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分析转染前后3组细胞中Pim-3mRNA和蛋白的表达,利用CCK-8试剂分析转染前后细胞增殖能力的变化,并进一步采用FCM法检测Pim-3表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡的影响。最后,利用蛋白质印迹法分析转染前后细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bad、pBad112、pBad136和pBad155表达的变化。结果:Pim-3siRNA能有效下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中Pim-3mRNA和蛋白的表达。Pim-3表达的下调能明显抑制Tca8113细胞的增殖并诱导其凋亡。此外,Pim-3表达下调能显著上调Bax蛋白的表达和下调Bcl-2和pBad112的表达(P<0.05),但不改变总的Bad蛋白和其他Bad磷酸化形式(pBad136和pBad155)蛋白的表达。结论:Pim-3表达下调诱导的细胞凋亡可能与Bax表达水平上升及Bcl-2和pBad112表达水平下降密切相关,因而Pim-3有望成为舌鳞状细胞癌治疗的分子靶点。