切应力通过Pim1/eNOS途径调节人脐静脉内皮细胞NO分泌

目的:探讨层流切应力是否可通过Pim1调节内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性,从而调节血管内皮细胞一氧化氮(NO)分泌。方法:体外原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),运用平行平板流动腔系统给HUVECs加载层流切应力(15 dyn/cm^2)。采用Western blot法检测Pim1蛋白表达及eNOS-Ser1177磷酸化水平;硝酸还原酶法检测NO分泌量;利用特异性小干扰RNA(siRNA)转染技术沉默Pim1基因后再检测上述指标的变化。结果:切应力作用HUVECs 15 min,可以显著上调Pim1蛋白表达(P<0.05),同时显著增强eNOS-Ser1177磷酸化水平(P<0.05),伴随HUVECs NO分泌显著增多(P<0.05)。转染siPim1可以抑制切应力诱导的Pim1表达(P<0.05),同时抑制eNOS-Ser1177磷酸化(P<0.05),NO分泌随之显著降低(P<0.05)。结论:流体切应力可能通过Pim1/eNOS途径调节血管内皮细胞NO分泌。

SIRT1/eNOS/NO通路在人参皂苷Rb1抗内皮细胞复制性衰老中的作用

目的:观察人参皂苷Rb1延缓人脐静脉内皮细胞(HUVECs)复制性衰老的作用,并探讨SIRT1/e NOS/NO通路在其中的作用机制。方法:建立原代HUVECs复制性衰老模型,根据细胞形态的变化、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色阳性率和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的表达水平评估HUVECs衰老情况;采用real-time PCR方法和Western blot法检测沉默SIRT1前后衰老细胞中e NOS和PAI-1的mRNA和蛋白表达,并检测细胞上清NO的含量。结果:累积细胞群体倍增水平(CPDL)为16的HUVECs可作为复制性衰老模型; 80μmol/L人参皂苷Rb1处理后衰老细胞内SIRT1和eNOS的mRNA及蛋白表达水平增加,NO含量增加(P <0. 05),而PAI-1的mRNA和蛋白表达水平下降(P <0. 05);沉默SIRT1后,衰老细胞内e NOS的mRNA及蛋白表达减少,PAI-1的mRNA及蛋白表达增加,NO含量减少(P <0. 05);与SIRT1沉默组比较,在沉默SIRT1基础上加用人参皂苷Rb1后,e NOS和PAI-1表达水平及NO的含量未见明显变化。结论:人参皂苷Rb1可通过调控SIRT1/e NOS/NO通路延缓HUVECs复制性衰老。

PIM1基因通过调控STAT3信号通路蛋白表达对食管癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨原癌基因PIM1通过调控信号转导子与激活子3(STAT3)信号通路对食管癌KYSE150细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法:分别以PIM1 siRNA和siRNA Control转染KYSE150细胞,命名为PIM1-siRNA组和NC组,同时设置空白对照Control组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组细胞中PIM1表达变化。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术和Transwell实验分别检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力。Western blot检测与细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移相关蛋白以及与STAT3信号通路相关蛋白表达水平。结果:PIM1-siRNA组KYSE150细胞中PIM1 mRNA和蛋白表达显著低于Control组(P<0.05)。PIM1-siRNA组KYSE150细胞光密度(OD)值、侵袭和迁移细胞数均显著低于Control组(P<0.05),凋亡率明显高于Control组(P<0.05),增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和p-STAT3蛋白表达水平均低于Control组(P<0.05),剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达水平高于Control组。Control组和NC组以上各指标相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:PIM1通过调控STAT3信号通路调节食管癌KYSE150细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移。

ECE1过表达通过eNOS/NO通路促进Ang Ⅱ诱导的体外培养大鼠心肌细胞肥大和凋亡

目的:探讨过表达内皮素转换酶1(ECE1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的体外培养大鼠H9C2心肌细胞肥大和凋亡的影响。方法:采用AngⅡ作用于体外培养的H9C2心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型。将细胞分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+质粒空载体(AngⅡ+NC)组和AngⅡ+ECE1过表达组。CCK-8法检测细胞活力;RT-qPCR检测ECE-1及心脏肥大因子心房钠尿肽(ANP)和脑钠肽(BNP)的mRNA表达水平;流式细胞术检测心肌细胞凋亡;Western blot检测ECE1、Bcl-2、Bax、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和p-eNOS的蛋白水平;硝酸还原酶法检测细胞中一氧化氮(NO)含量。结果:与空白对照组相比,AngⅡ组中ECE1表达、ANP和BNP mRNA表达、Bax蛋白表达及细胞凋亡显著增加(P<0.05),而细胞活力、NO含量及Bcl-2和p-eNOS蛋白水平显著下降(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+ECE-1过表达组中ECE1表达、ANP和BNP的mRNA表达、Bax蛋白表达及细胞凋亡进一步增加(P<0.05),而细胞活力、NO含量及Bcl-2和p-eNOS蛋白水平进一步下降(P<0.05)。结论:ECE1过表达可能通过调控eNOS/NO通路而促进AngⅡ诱导的体外培养大鼠H9C2心肌细胞发生肥大和凋亡。

ECE-1基因启动子甲基化调控AKT/eNOS通路对心肌肥厚的影响

目的探讨压力超负荷心肌肥厚大鼠内皮素转换酶-1(ECE-1)基因启动子的甲基化状态及其调控蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(AKT/eNOS)信号通路促进心肌肥厚发病的机制。方法雄性SD大鼠30只随机分成空白组、假手术组、实验组,每组10只。实验组通过腹主动脉缩窄术构建压力超负荷心肌肥厚模型,假手术组分离动脉但不结扎,空白组不手术;第43天检测心重比、心脏超声、心肌形态学改变;RT-qPCR检测心房利钠肽(ANP)和脑利钠肽(BNP)含量;免疫组化法检测ECE-1在心肌组织中的表达;MSP法检测ECE-1基因甲基化状态;Western blot法检测ECE-1、p-AKT、p-eNOS等表达。结果与假手术组比,实验组心重比、左室舒末后壁厚度增加,左室射血分数、左室短轴收缩率减小,形态学观察到实验组心肌明显肥厚(P<0.01),ANP和BNP mRNA表达升高(P<0.01)。与假手术组比,实验组大鼠心肌组织中ECE-1在细胞质表达上调(P<0.01);存在ECE-1非甲基化大鼠的ECE-1蛋白表达上调,p-AKT和p-eNOS蛋白表达下调(P<0.01)。结论压力超负荷心肌肥厚大鼠ECE-1基因启动子的非甲基化可能导致ECE-1表达增加,p-AKT、p-eNOS水平下降,其可能通过抑制AKT/eNO途径促进心肌肥厚的发生。

Exendin-4对Ⅰ型糖尿病小鼠内皮祖细胞功能及AKT/eNOS信号通路的影响

目的探讨Exendin-4对Ⅰ型糖尿病小鼠内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖、迁移、黏附、衰老的影响及对AKT/eNOS信号通路的影响。方法采用密度梯度离心法分离并培养6月龄Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs,并用不同浓度的Exendin-4(1、5、10、25μmol·L^(-1))处理EPCs,观察EPCs体外克隆形成及增殖能力。同时观察其对糖尿病小鼠EPCs迁移、黏附及衰老的影响。Western blot检测Exendin-4处理对EPCs蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(AKT/eNOS)信号通路的影响。结果Exendin-4处理可增加Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs克隆形成及增殖能力,尤以10μmol·L^(-1)时作用效果最佳。Exendin-4处理可增加Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs的体外迁移、黏附功能,并抑制细胞衰老。Western blot结果显示,Exendin-4可增强AKT及eNOS磷酸化水平,而GLP-1R抑制剂Exendin-9-39和AKT抑制剂MK-2206则可以阻断这种效应。结论Exendin-4可改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs增殖、迁移、黏附能力并抑制细胞衰老,其机制可能与调控AKT/eNOS信号通路有关。

1-磷酸鞘氨醇受体2介导PI3K/AKT/eNOS通路抑制甲型流感病毒诱导的病毒性肺炎

目的:探讨1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)对甲型流感病毒诱导的病毒性肺炎的作用及机制。方法:采用甲型流感病毒鼠肺适应株FM1滴鼻感染野生C57BL/6小鼠和S1pr2^(-/-)小鼠,建立甲型流感病毒性肺炎动物模型。病毒感染4和6 d时观察比较对照组(模型组的野生小鼠)、JTE-013(S1PR2高效拮抗剂)处理的小鼠及S1pr2^(-/-)小鼠肺组织的病理改变,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白浓度、细胞总数及细胞因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]的表达,Western blot法检测小鼠肺组织的AKT和e NOS的磷酸化水平。结果:与模型对照组的野生鼠比较,JTE处理组和S1pr2^(-/-)组甲型流感病毒性肺炎更加严重;BALF中的蛋白浓度,总细胞数及炎性细胞因子表达显著增加;且PI3K下游靶点AKT和e NOS磷酸化显著增高(P<0.01)。结论:S1PR2通过介导PI3K/AKT/e NOS信号转导通路,调节NO生成,抑制血管通透性和炎性细胞因子释放,从而减轻甲型流感病毒诱导的病毒性肺炎。

松花粉水提液调节ENO1过表达荷瘤裸鼠的实验研究

探究松花粉水提液是否可以抑制过表达ENO1的荷瘤裸鼠瘤块增殖及是否通过JUN信号通路蛋白(Rho、MAP2K4、KRAS+HRAS+NRAS蛋白)来影响瘤块增殖。方法 采用过表达ENO1稳转肝癌细胞株使裸鼠致瘤,并观察瘤体生长情况。用免疫印迹试验(westernblot,WB)检测JUN信号通路蛋白(Rho、MAP2K4、KRAS+HRAS+NRAS蛋白)的变化。结果 松花粉水提液可以抑制ENO1过表达的荷瘤裸鼠瘤块增长,JUN信号通路蛋白(Rho、MAP2K4、KRAS+HRAS+NRAS)的表达下降,JUN信号通路蛋白可影响瘤块增殖。结论 松花粉水提液是通过抑制JUN信号通路蛋白表达来达到抑制ENO1过表达的荷瘤裸鼠瘤块增殖和肝癌发展的作用。

AQP1通过Akt/eNOS调节层流切应力诱导的人脐静脉内皮细胞血管生成

切应力诱导的内皮细胞血管生成(angiogenesis)在内皮损伤修复中有重要作用,水通道蛋白1(AQP1)与血管生成密切相关,本研究探讨AQP1是否可通过调节Akt/eNOS信号通路,从而调节层流切应力诱导的内皮细胞血管生成。

IL-7介导的JAK/STAT信号通路在白藜芦醇抗急性T淋巴细胞白血病中的作用研究

目的:观察T-ALL细胞株和小鼠模型中IL-7及JAK/STAT通路中信号分子的变化,探讨白藜芦醇抗T-ALL的作用机制。方法:将T-ALL细胞株Molt4分成对照、DMSO处理和白藜芦醇处理(Res)共3组,其中对照组不做任何处理,DMSO组用0.05%DMSO处理48 h,Res组用200μmol/L白藜芦醇处理48 h。将15只6-8周龄健康雌性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照、T-ALL模型(T-ALL)和白藜芦醇处理(Res)共3组,其中对照和T-ALL组均以0.05%DMSO灌胃处理,Res组以10 mg/ml白藜芦醇灌胃处理。采用RT-qPCR法检测各组细胞和小鼠脾脏组织中IL-7、IL-7R及靶基因Pim1 mRNA的表达,CCK-8法检测细胞的增殖情况,Western blot检测各组细胞和小鼠脾脏组织JAK1、JAK3、STAT5、Pim1及磷酸化JAK1(p-JAK1)、磷酸化JAK3(p-JAK3)、磷酸化STAT5(p-STAT5)的蛋白表达,ELISA法检测各组细胞和小鼠血清中IL-7、IL-7R水平。结果:Res抑制Molt4细胞增殖,下调Molt4细胞及T-ALL小鼠脾脏中p-JAK1、p-JAK3、p-STAT5、Pim1蛋白相对表达量以及Pim1、IL-7、IL-7R mRNA的表达水平,降低Molt4细胞及T-ALL小鼠血清中IL-7、IL-7R的水平(P<0.05)。结论:白藜芦醇可能通过下调IL-7和IL-7R的表达水平,抑制其介导的JAK/STAT信号通路,进而降低靶蛋白Pim1表达发挥抗T-ALL的作用。

基于S1PR1/PI3K/Akt/eNOS信号通路探究健脾化痰方对高脂血症脾虚痰浊小猪血管内皮的保护机制

目的:基于S1PR1/PI3K/Akt/eNOS信号通路探究健脾化痰方对高脂血症(HLP)脾虚痰浊小猪血管内皮的保护机制。方法:普通级广西巴马小型猪15只按随机数字表法随机分为正常组、模型组和健脾化痰组,每组5只。正常组予基础饲料喂饲,模型组和健脾化痰组均予高脂饲料喂饲,造模周期为24周,其中健脾化痰组小型猪在0~24周均应用健脾化痰中药干预。24周后全自动生化分析仪检测各组小猪血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量变化;ELISA法检测各组小猪血清NO、ET-1水平;Western blot法检测各组小猪冠状动脉内皮PI3K、p-Akt/Akt、S1PR1、p-eNOS/eNOS蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组TG、TC、LDL-C、ET-1水平升高(P<0.01),HDL-C、NO水平降低(P<0.05,P<0.01),冠状动脉内皮PI3K、p-Akt/Akt、S1PR1、p-eNOS/eNOS蛋白表达水平下调(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,健脾化痰组小猪TG、LDL-C、ET-1水平降低(P<0.05,P<0.01),NO水平升高(P<0.01);健脾化痰组小猪冠状动脉内皮PI3K、p-Akt/Akt、S1PR1、p-eNOS/eNOS蛋白表达水平上调(P<0.05,P<0.01)。结论:健脾化痰中药具有良好的保护血管内皮功能的作用,其机制可能是通过激活S1PR1/PI3K/Akt/eNOS信号通路实现的。

人参皂苷Rg_1通过PI3K/Akt/eNOS信号通路调控异丙肾上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌的抗氧化作用

目的:观察人参皂苷Rg_1预处理对异丙肾上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)通路的影响。方法:采用异丙肾上腺素建立SD大鼠急性心肌缺血模型,将50只大鼠随机分为正常组,模型组,葛根素组,人参皂苷Rg_1高、低剂量组(20,10 mg·kg^(-1));Moor激光血流成像系统观测各组大鼠心脏表面血流值;酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定各组大鼠血清中肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH),一氧化氮(NO)的水平以及心肌中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平;实时荧光定量-聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测各组大鼠心肌内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达变化;蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测各组大鼠心肌PI3K,Akt,p-Akt蛋白的表达变化。结果:与正常组比较,模型组大鼠心脏表面平均血流量明显下降,血清NO降低,CK,LDH升高;心肌MDA含量升高,GSH-Px含量下降,eNOS mRNA含量显著降低,PI3K/Akt通路蛋白的表达有所降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,人参皂苷Rg_1高、低剂量组,心肌表面平均血流有显著提升,血清NO升高,CK,LDH降低,心肌MDA含量降低,GSH-Px含量升高,eNOS mRNA表达含量升高,PI3K/Akt通路蛋白的表达有所升高(P<0.05,P<0.01)。结论:人参皂苷Rg_1可以通过调控PI3K-Akt-eNOS信号通路改善急性心肌缺血大鼠心脏变化防治心血管病变。

腺病毒介导的shRNA下调GLP-1R表达对小鼠内皮祖细胞功能的影响及机制研究

目的探讨腺病毒介导的shRNA下调胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)基因表达对小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)迁移、黏附、衰老的影响及其可能机制。方法采用密度梯度离心法分离并培养小鼠骨髓EPCs,以腺病毒为载体将靶向GLP-1R的shRNA干扰重组体转染至体外培养的EPCs;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及免疫印迹法(Western Blot)验证GLP-1R基因表达下调。利用Transwell小室检测EPCs迁移能力,黏附实验检测其黏附能力,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老,Western Blot检测AKT/eNOS信号通路变化情况。实验分为正常组(在腺病毒转染步骤以EGM-2代替腺病毒液)、对照组(转染表达绿色荧光蛋白的空病毒)和转染组(转染靶向GLP-1R并表达绿色荧光蛋白的RNA干扰重组腺病毒)。结果靶向GLP-1R的shRNA成功转染体外EPCs并下调GLP-1R mRNA及蛋白表达(P<0.01);功能实验显示,与对照组比较,转染组EPCs迁移能力明显降低(P<0.01),黏附能力受损(P<0.01),细胞衰老增加(P<0.01);信号通路显示AKT/eNOS磷酸化水平明显降低(P<0.01)。结论GLP-1R基因表达下调能显著抑制小鼠EPCs迁移及黏附能力,并诱导细胞衰老,其机制可能与调控AKT/eNOS信号通路有关。

ENO1在胃癌干细胞中表达及其与胃癌侵袭转移的相关性研究

[目的]探讨ENO1在胃癌干细胞中的表达及其对胃癌侵袭转移的影响。[方法]以胃癌SNU-5模型,实时荧光定量PCR和双色细胞免疫荧光检测ENO1在其分选的CD44^+细胞中的表达情况。运用慢病毒载体稳定干扰SUN-5中ENO1的表达,并用实时荧光定量PCR和Western blot检验干扰效率。流式细胞术分选稳定干扰ENO1的SNU-5中CD44^+细胞后(shRNA-ENO1),实时荧光定量PCR检测其Oct-4、Sox 2以及干性相关基因Nanog的表达,同时分别进行细胞成球实验、体外侵袭与体内致瘤的胃癌干细胞生物学特性研究,Western blot检测ENO1对胃癌干细胞侵袭转移影响的相关分子机制。[结果] SNU-5的CD44^+细胞中ENO1基因和蛋白表达明显高于CD44-细胞,并建立稳定干扰ENO1的SUN-5。shRNA-ENO1细胞中干性基因Oct-4、Sox 2和Nanog中m RNA的表达显著低于PLV-Ctr细胞(P<0.05)。与PLV-Ctr细胞相比较,shRNA-ENO1细胞的自我更新能力、侵袭能力和肿瘤重量显著降低。Western blot检测shRNA-ENO1细胞中Vimentin、Snail和N-cadherin下调表达,同时E-cadherin上调表达,并伴随AKT和PI3K的磷酸化水平降低,提示ENO1的作用可能通过PI3K/AKT信号通路激活。[结论] ENO1在胃癌干细胞中高表达,其在调控胃癌侵袭转移能力中发挥重要作用。

雷公藤甲素对舌鳞癌细胞自噬的影响及相关机制研究

目的:研究雷公藤甲素(TP)对人舌鳞状细胞癌细胞(TSCCs)自噬的影响及相关机制。方法:用2.5~20μg/L的TP处理体外培养的TSCCs CAL-27和SCC-25,MTT实验检测细胞活力,MDC染色检测细胞中自噬泡,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中自噬相关蛋白,凋亡相关蛋白,STAT3-PIM-1信号通路蛋白表达情况,并通过加入自噬抑制剂检测自噬与凋亡的关系。结果:TP能够诱导TSCC细胞发生自噬,并且对肿瘤细胞有明显的凋亡诱导作用,促进凋亡蛋白PARP和Caspase-9剪切体的表达,同时下调SATA3-PIM-1蛋白表达,加入自噬抑制剂后细胞凋亡发生率减少。结论:TP可能通过抑制STAT3-PIM-1信号通路诱导TSCCs发生自噬,并进一步诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

高车前素对大肠癌细胞生长和转移的影响

高车前素是一种分离自菊科植物毛莲蒿的黄酮类化合物,具有多种生物活性。原癌基因PIM1可调节癌细胞存活、分化、增殖、凋亡和肿瘤发生。为了揭示高车前素对大肠癌细胞生长和转移的影响,及其对PIM1表达的影响,本研究应用不同浓度的高车前素处理人大肠癌细胞系SW620,并通过转染PIM1 siRNA来敲低大肠癌细胞中PIM1的表达,通过转染高表达PIM1的质粒载体再上调PIM1的表达。研究发现敲低PIM1可显著抑制大肠癌细胞的增殖和侵袭,并促进细胞凋亡;高车前素处理以浓度依赖性方式抑制大肠癌细胞系SW620的增殖和侵袭,并增加细胞凋亡。此外,高车前素处理以浓度依赖性方式抑制PIM1的表达,而上调PIM1的表达可显著抑制高车前素对大肠癌细胞系SW620的增殖、凋亡和侵袭能力的影响;高车前素以浓度依赖性方式抑制JAK2/STAT3的活化,并上调癌细胞内ROS水平;应用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理可恢复JAK2/STAT3信号传导的激活及PIM1的表达。本研究证实原癌基因PIM1在大肠癌中起着致癌基因的作用,而高车前素通过ROS/JAK2/STAT3信号通路来调节PIM1的表达,进而发挥其抗肿瘤作用。