小麦Pinb基因启动子区CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经逐渐成熟并在多种植物中得到成功应用,促进了基因功能的研究。小麦籽粒硬度是决定小麦加工品质的重要性状,Pinb是控制籽粒硬度的关键基因之一。本研究以小麦Pinb基因为对象,联合采用常规PCR和Golden Gate cloning技术,构建了包含小麦Pinb基因启动子区双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体。将重组载体转入小麦原生质体中进行sgRNA活性的检测,在两个靶点位置均发生了突变,编辑效率分别为4.57%和4.37%,基因编辑类型包括碱基替换和碱基缺失。该研究为在小麦中实现Pinb基因的定点突变奠定了基础,对其功能研究和小麦品质改良均具有重要意义。

二角山羊草Pinb基因的克隆与表达分析

根据已报道的小麦Pinb基因的保守序列,设计合成了1对特异性引物,对二角山羊草(Aegilops bicornis,SS)的基因组DNA进行Pinb基因扩增、克隆、序列分析,发现了1个新型Pinb等位基因,基因长360bp,编码119个氨基酸残基,对应于麦类作物PinB成熟蛋白结构区域,具有其特有的WPTKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。与软粒小麦cv.Capitole的Pinb-D1a相比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%和91.6%。RT-PCR证实了Pinb基因在籽粒胚乳中的表达。研究结果表明,二角山羊草中包含着与小麦差异较大的籽粒硬度控制基因,为栽培小麦品质改良提供了丰富的遗传资源。

籽粒硬度Pinb基因反义表达载体构建及遗传转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状。利用含有Ubi启动子、Bar表达盒的基础质粒pAHC25,构建了含有Pinb基因的植物反义表达载体pAHantipB,其中pAHantipB载有小麦籽粒硬度Pinb基因的反向序列,可用于小麦遗传转化,利用花粉管通道法将其转入软质小麦品种京411,获得1株转基因植株,T1代转基因植株抗性筛选及PCR检测结果表明,转化率为0.17%。基因组DNA斑点杂交证实了外源基因在受体小麦基因组中的整合。

Pina^m-Pinb^m-Gsp^m串联三基因表达载体的构建及其在普通小麦中的转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状之一,主要由5D短臂上的Hardness(Ha)位点的两个主效基因,即Puroindoline a(Pina-D1)和Puroindoline b(Pinb-D1)控制,同时受基因Grain Softness Protein-1(Gsp-1)的影响。本研究以一粒小麦(T.monococcum)DV92作为Pinam、Pinbm和Gspm基因的供体,将三基因各自完整的表达盒串联连接到载体pGEM-TEasy上,构建Pinam-Pinbm-Gspm三基因串联的表达载体。利用基因枪介导的转化方法转化普通小麦科农199幼胚,共轰击5608个小麦幼胚愈伤,经Biolaphos(化学除草剂)筛选,获得933株再生植株,经PCR检测,鉴定出11株阳性植株,有关转基因小麦的籽粒硬度还需进一步实验验证;本实验实现了串联三基因在普通小麦中的遗传转化,为利用基因枪介导的遗传转化方法改善小麦籽粒硬度提供了可行性。

小麦puroindoline及其相关基因分子遗传基础研究进展

籽粒硬度是重要的小麦品质性状之一,对小麦的磨粉品质和加工品质有重要影响。控制籽粒硬度的主效基因puroindoline位于5D染色体的短臂上,可分为Pina和Pinb2种类型。Pina和Pinb紧密连锁,编码区均为447个碱基,没有内含子,共同形成小麦籽粒硬度的分子遗传基础。目前,普通小麦和山羊草中均已发现多种puroindoline变异类型,其中引起小麦籽粒硬度大幅度升高的Pina-D1b类型的分子机制为从编码区第23个碱基开始缺失15380个碱基。Puroindoline除了对小麦籽粒硬度有重要影响之外,对其它品质性状也有重要影响,不同puroindoline变异类型之间小麦品质具有一定差异。另外,与puroindoline紧密连锁的Gsp-1基因变异类型更为丰富,但对籽粒硬度没有明显的调节作用。最近发现的与puroindolineb高度同源的基因Pinb-2v具有4种类型,分别位于小麦7A、7B和7D染色体上,可能对籽粒硬度具有微效的调节作用。本文通过对puroindoline的分子特征和突变类型以及相关功能进行分析和总结,旨在为中国小麦品质的基因工程改良提供参考。