马氏珠母贝丝裂原活化蛋白激酶p38的克隆与表达

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白激酶通过磷酸化级联介导的信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得马氏珠母贝MAPK p38(PmMAPK p38)cDNA全长序列并对其序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了PmMAPK p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示,PmMAPK p38 cDNA全长为1516 bp,开放阅读框长度为1071 bp,共编码356个氨基酸,理论分子量为40.88 ku;结构域预测结果表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S_TKc结构域;多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高;荧光定量分析结果表明,该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为外套膜,最低是闭壳肌。马氏珠母贝在受到LPS刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在刺激后2 h达到最高,12 h降到最低,最高约为最低的5倍;而在哈维氏弧菌刺激后,PmMAPK p38的相对表达量在2 h达到最高,8 h降到最低,最高约为最低的4倍。研究表明,PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应,尤其是在抵御外部细菌侵入中起着重要的作用。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了基础资料。

超滤对马氏珍珠贝肉蛋白酶解液特性的影响

分别采用凝胶过滤色谱法和高效液相色谱法研究了马氏珍珠贝肉蛋白酶解液超滤前后肽的相对分子质量分布以及氨基酸组成的变化，分析了超滤过程中膜通量及感官特性的变化，并对超滤膜的选择性及分离效果进行了评价．结果表明：随着超滤时间的延长，马氏珍珠贝肉蛋白酶解液膜通量不断减小；透过液的鲜味明显提高，腥味和苦味基本消失；透过液中含有相对分子质量大于截留相对分子质量（5000）的多肽，超滤膜实际有效截留相对分子质量约为7000～8000，相对分子质量小于4500的多肽在透过液中得到有效富集；超滤处理后，透过液肽态氨基酸中鲜味氨基酸占总氨基酸的比例高于原酶解液，而苦味氨基酸和疏水性氨基酸占总氨基酸的比例均低于原酶解液．

不同酶水解马氏珍珠贝蛋白的特性研究

本研究采用Alcalase 2.4L、Protamex、Papain、PTN6.0S、Flavorzyme 500MG、Neutrase和内源酶水解马氏珍珠贝肉蛋白,探讨了各种酶的酶解特性、产物的氨基酸组成及肽相对分子质量分布规律和呈味特征的差异。结果表明,PTN6.0S酶解产物的蛋白质利用率、肽得率和水解度均较高,而内源酶均最低。各酶解产物中,谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量均较高。同一氨基酸在不同酶解产物中回收率存在较大差异,色氨酸、苏氨酸、脯氨酸和天冬氨酸在马氏珍珠贝蛋白酶解产物中主要以多肽的形式存在,各酶解产物中氨基酸的回收率和释放率较高的氨基酸与各酶的主要作用位点有很好的对应关系;各种酶均能不同程度地降解马氏珍珠贝肉蛋白和相对分子质量大于5000Da的肽断。各酶水解产物肽相对分子质量分布差异主要体现在3000以下。在各酶解产物中,Papain酶解产物风味最佳,鲜味最高,苦味和腥味最低。

马氏珠母贝蛋白的分离及分子量分布研究

试验结果表明，马氏珠母贝全脏器各分离蛋白组分占总蛋白含量分别为：非蛋白氮1．48％，肌浆蛋白33．20％，肌原纤维蛋白13．14％，碱溶性蛋白21．54％，基质蛋白30．65％；贝肌肉各分离蛋白组分占总蛋白含量分别为：非蛋白氮0．83％，肌浆蛋白26．56％，肌原纤维蛋白18．48％，碱溶性蛋白30．34％，基质蛋白23．79％；马氏珠母贝蛋白氨基酸组成均衡，呈味氨基酸及支链氨基酸含量高，但在各蛋白组分中的含量存在一定差异性。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定的分子量分布结果显示，2种原料蛋白的肌浆蛋白分子量分布范围较宽，集中在200～19kDa，肌原纤维蛋白分子量分布集中在200～45kDa。碱溶性蛋白集中分布在41-3kDa。

马氏珠母贝肉酶解蛋白抗疲劳功能的初步研究

目的对马氏珠母贝肉酶解动物蛋白(enzymatic hydrolyzed animal protein,EAP)的抗疲劳功能进行初步研究。方法小鼠负重游泳实验和力竭游泳运动实验,检测小鼠负重游泳时间,力竭运动后肝糖原和血清尿素氮的含量。结果3种剂量的EAP均能不同程度地延长小鼠负重游泳时间,有效降低力竭运动后小鼠肝糖元的消耗和血清尿素氮含量。结论EAP具有明显的抗疲劳功能。

马氏珠母贝肌肉提取蛋白热变性动力学

为进一步了解水产蛋白的受热影响规律,更好利用它们的机能特性,该文研究热处理过程中马氏珠母贝肌肉提取蛋白(水溶性蛋白和盐溶性蛋白)的变性动力学,水溶性蛋白和盐溶性蛋白可分别用反应级数为1.1和1.3的方程较好地描述。研究结果表明,在60、70、80、90和100℃条件下水溶性蛋白变性的D值(90%蛋白变性所需时间)分别为33333、12500、3333、1667和769s,而盐溶性蛋白热变性D值为50000、12500、5000、2000和1250s;水溶性蛋白和盐溶性蛋白的Z值(D值降低90%的温度变化)分别为24.1和25.0℃,变性活化能分别为101.83和112.78kJ/mol,盐溶性蛋白比水溶性蛋白更为耐热。研究结果为进一步开发利用马氏珠母贝肌肉蛋白提供参考。

合浦珠母贝肉酶解产物的抗氧化稳定性与功能特性

酶解合浦殊母贝内蛋白制备抗氧化肽的粗提产物，以合浦珠母贝清除DPPH自由基、OH自由基、超氧阴离子能力变化为指标，测定其抗氧化稳定性和功能特性。化学稳定性包括受温度、贮藏浓度、pH、不同干燥方式的影响，生物稳定性为胃肠道消化耐受度，以及功能特性包括乳化性、吸水保湿能力和吸油能力。结果表明：合浦珠母贝酶解产物具有较弱的耐热性，低温条件下最佳贮藏浓度为10－50mg／mL，在碱性环境中8h会丧失活性，而冷冻干燥较有利于保持其抗氧化活性。产物还含有较强的乳化性和吸油吸水保湿能力，但在模拟胃肠道消化过程中活性保持较差，这些性质均有利于其在化妆品中的应用，而不适用于口服抗氧化功能食物药物，将为其后续相应的工业化应用提供依据。

Pancreatin酶解马氏珍珠贝肉蛋白过程中产物性质研究

研究了Pancreatin酶解马氏珍珠贝内蛋白过程中氨基酸、可溶性氮、肽的释放规律以及产物的风味评价。游离氨基酸和可溶性氮含量在酶解过程中逐渐增加,但不同氨基酸以及同一氨基酸在不同水解时间段释放速率均不一致,控制酶解马氏珍珠贝内蛋白可提高其营养价值。水解24h后产物中分子质量大于10 000 u的肽段几乎完全被降解;水解6 h后,Pancreatin降解分子质量10 000 u以下肽的能力较弱。酶解产物鲜味随酶解时间延长不断增强,苦味在开始酶解6 h内不断增加,随后下降。

响应面法优化微波辅助酶解合浦珠母贝蛋白工艺

研究微波对酶解合浦珠母贝蛋白的影响,以水游离氨态氮含量和抗氧化活性为指标,选择较好的作用酶,通过单因素试验确定料液比、加酶量(E/S)、微波温度、微波功率及时间和后续水浴时间等因素水平,以水解度和DPPH自由基清除率为响应值,响应面法优化酶解合浦珠母贝蛋白工艺条件。结果表明,微波辅助蛋白酶酶解合浦珠母贝蛋白工艺条件为微波温度58℃、微波功率300 W、微波时间17 min、加酶量5 000 U/g,后续在58℃条件下再水浴1.5 h。预测响应值为0.224 4,水解度达到26.15%,验证实验证明与响应优化模型预测值误差不大,二次多元拟合度较好。

马氏珍珠贝蛋白降解与抗氧化性关系的研究

以马氏珍珠贝肉为原料固体发酵制备米曲霉,采用还原力、DPPH自由基清除力、氧自由基清除能力(ORAC)三种指标评价酶解过程中抗氧化性的变化。利用总氮、氨氮、肽含量以及色泽表征蛋白质降解规律,并进一步探究其蛋白降解规律与抗氧化活性之间的内在联系。结果表明,酶解液的抗氧化性随酶解时间的延长大体呈现增加的趋势,酶解36h后,还原力增加到初始的2.20倍;DPPH自由基清除力增加至初始的1.55倍;ORAC最大达到2834.67μmolTrolox/g,是等质量的谷胱甘肽的1.13倍。总氮增加到初始的1.89倍,氨氮增加到初始的2.57倍。在颜色变化方面,色深物质和色率均随着酶解时间的延长而增加。通过相关性分析发现氨氮的变化与抗氧化性之间有显著的相关性。

2种珍珠贝的外套膜同工酶及粘液蛋白的电泳比较

通过对企鹅珍珠贝、马氏珠母贝外套膜组织及粘液进行垂直板状聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离 ,分析这 2种珍珠贝的粘液蛋白和外套膜的SOD、MDH、EST、LDH同工酶谱带。结果表明 ,2种珍珠贝同工酶的表达 ,既呈现出明显差异 ,又有一些相似的特征。对比粘液的蛋白谱带和其同工酶谱带 ,发现主要的蛋白带具有明显的SOD酶活性。

马氏珠母贝细胞内视黄酸结合蛋白表达及其与类胡萝卜素的相关性分析

【目的】明确细胞内视黄酸结合蛋白(CRABP)对马氏珠母贝吸收代谢类胡萝卜素的影响,为培育富含类胡萝卜素的马氏珠母贝养殖新品系打下基础。【方法】采用RACE克隆马氏珠母贝CRABP基因(PmCRABP)cDNA全长序列,并以实时荧光定量PCR检测分析PmCRABP基因在各组织中的表达特征及其在黄白闭壳肌中的表达量。【结果】PmCRABP基因cDNA全长1778 bp,开放阅读框(ORF)长366 bp,编码121个氨基酸,其5'非翻译区(5'UTR)长125 bp,3'UTR长1287 bp。PmCRABP的分子量13.51 kD,理论等电点(pI)5.68,脂溶性系数62.81,不稳定指数35.38,总平均亲水性-0.517,其第5~120个氨基酸为Lipocalin家族的结构域。PmCRABP氨基酸序列与新对虾(Metapenaeus ensis)CRABP氨基酸序列的相似度最高,同属于CRABP蛋白,且二者的空间结构极其相似。PmCRABP基因在马氏珠母贝肝胰腺中的表达量最高,其后依次是外套膜、鳃和闭壳肌,各组织的表达量差异显著(P<0.05,下同)。黄白闭壳肌个体的类胡萝卜素含量与PmCRABP基因相对表达量存在显著差异,且二者间呈明显的正相关。【结论】PmCRABP参与了马氏珠母贝的类胡萝卜素代谢。

马氏珠母贝msi60基因表达量与经济性状的相关分析

[目的]探讨矿化基因、贝壳和珍珠经济性状之间的相关关系。[方法]选择47个培育优质珍珠的马氏珠母贝,测量贝壳的壳宽、壳高、壳长、绞合线长、总壳重、左壳重、珠层厚度及珍珠的直径、重量、珠层厚度,并分析矿化基因msi60在外套膜内缘组织的相对表达量,珍珠经济性状和贝壳经济性状之间的相关关系。[结果]珍珠的珠层厚度、珍珠直径和珍珠重量3个经济性状均与受体贝贝壳的壳宽、壳长、总壳重和左壳重呈显著相关,推测育珠贝的生长状况在一定程度上影响珍珠的培育;msi60在外套膜内缘的相对表达量与珍珠重量之间存在相关性(P=0.059),贝壳和珍珠的珍珠层厚度存在显著相关性(P=0.019),推测在马氏珠母贝中,贝壳的矿化和珍珠的矿化可能具有共同的上游调控元件。[结论]msi60在形成贝壳珍珠质层的外套膜内缘组织中的基因表达量与珍珠的经济性状相关。该研究为马氏珠母贝生物矿化分子机制的研究提供基础资料。

马氏珠母贝酶解蛋白粉营养组成及其对斑马鱼学习记忆能力的影响

【目的】分析马氏珠母贝酶解蛋白粉(Enzymolysis protein powder of Pinctada martensii,EPP)营养组成,并探讨EPP改善自然衰老斑马鱼学习记忆能力的功效及其可能的作用机制。【方法】采用国标法测定EPP营养组成。18月龄斑马鱼分模型组和实验组,另取6月龄斑马鱼作对照组,实验组饲喂EPP[3 g/(kg•d)]30 d,其它组喂食正常饲料,通过T迷宫试验观察各组斑马鱼学习记忆能力,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测鱼脑组织中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10含量及脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)水平。【结果】EPP含有质量分数78.28%的蛋白质,富含谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、精氨酸等氨基酸,其钙、铁、锌元素含量较高。与模型组相比,EPP可以显著提高实验组斑马鱼觅食成功率及右臂游动路程占比(P<0.05),降低潜伏期;与模型组相比,EPP可以降低实验组斑马鱼脑组织炎症因子IL-1β、TNF-α含量(P<0.05),分别降低了3.18、2.77 pg/mg,同时提高其BDNF的水平(P<0.05),提高了54.99 pg/mg,但对IL-10含量无显著影响(P>0.05)。【结论】EPP具有改善自然衰老斑马鱼学习记忆能力的功效,其机制与EPP缓解大脑的炎症状况、提高脑源性神经营养因子水平有关。

增强马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白质热稳定胶体筛选研究

以珍珠产业副产物马氏珠母贝肉为研究对象,在前期研究结果基础上,筛选有效提高马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白(WSP)热稳定性亲水胶体,并分析不同热处理条件下最佳亲水胶体对马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白(WSP和F-D WSP)热稳定性的影响,研究结果显示:同一热处理温度条件下,卡拉胶、果胶及瓜尔胶体对WSP的热稳定性的影响存在明显差异(P<0.05)。在热处理温度范围内(60~100℃),卡拉胶对于稳定WSP的效果最好。卡拉胶对WSP和F-D WSP的热稳定性影响作用存在明显差异性(P<0.05),在热处理温度范围内(60~100℃),随着热处理温度的不断提高,卡拉胶对WSP稳定性作用逐渐增强,而对F-D WSP的稳定性作用则呈先增强后减弱的趋势。

柱前衍生化-HPLC测定马氏珠母贝肉中氨基酸的含量

以邻苯二甲醛-9-芴甲基氯甲酸酯为衍生化试剂，对氨基酸进行柱前衍生，建立了35℃下，醋酸钠缓冲液、甲醇及乙腈为流动相，用EclipseAAA氨基酸分析柱和二极管阵列检测器的氨基酸色谱分析方法，18种氨基酸在36min内获得了较好的分离，在一定浓度范围内，氨基酸的峰面积与浓度的线性相关系数在0．9906～0．9998之间，相对标准偏差为1．96％～5．45％（n=5）。并测定了马氏珠母贝肉蛋白中氨基酸的组成和含量。结果表明，马氏珠母贝肉蛋白中含有至少18种氨基酸，其中8种必须氨基酸总含量达39％以上，是一种优质的功能食品原料。

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmTYRL-1基因的分子特征与表达分析

酪氨酸酶(Tyrosinase)是Ⅲ-型铜蛋白超家族的一员,在色素沉着、伤口愈合、先天免疫和角质层形成等过程发挥重要作用。为了探究酪氨酸酶样蛋白1基因在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究运用RACE技术获得马氏珠母贝酪氨酸酶样蛋白1基因(PmTYRL-1)的cDNA序列全长,并检测PmTYRL-1在各个组织的表达模式。结果表明:PmTYRL-1序列全长2406bp,其中5'UTR为169bp,3'UTR为116bp,开放阅读框(ORF)为2121bp,编码706个氨基酸。预测其分子量(MW)为81112.60Da,理论等电点(PI)为8.67。SMART软件分析PmTYRL-1氨基酸序列具有典型的酪氨酸酶结构域。多序列比对发现PmTYRL-1与其它物种的同源性较低。qPCR结果表明,PmTYRL-1在边缘区显著高表达,其次是套膜区和肝胰腺。综上所述,PmTYRL-1可能参与马氏珠母贝的贝壳形成,可为进一步探究PmTYRL-1在马氏珠母贝生物矿化中的作用提供理论基础。

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmGIFLP基因的分子特征与表达分析

胃内因子（gastric intrinsic factor,GIF）是一种转运蛋白,在介导维生素B12（VB12）维持机体正常造血功能、神经系统功能和免疫调节功能等方面发挥重要作用。为探究胃内因子样蛋白（gastric intrinsic factorlike protein,GIFLP）在马氏珠母贝免疫调节中的作用,本研究运用RACE技术获得马氏珠母贝胃内因子样蛋白基因（Pm GIFLP）的c DNA序列全长,并检测Pm GIFLP在各个组织的表达模式。结果表明：Pm GIFLP序列全长1 721 bp,其中5＇UTR为78 bp,3＇UTR为116 bp,开放阅读框（ORF）为1 527 bp,编码508个氨基酸。预测其分子量（MW）为56 644.84 Da,理论等电点（p I）为7.13。SMART软件分析显示Pm GIFLP氨基酸序列具有2个典型的钴胺素结合结构域。多序列比对发现Pm GIFLP与其它物种的同源性较低。q RT-PCR结果表明Pm-GIFLP基因在肝胰腺中显著高表达,其次是外套膜边缘区、性腺和足。综上所述,Pm GIFLP可能参与马氏珠母贝的免疫调节作用,可为进一步探究Pm GIFLP在马氏珠母贝中免疫防御中的作用积累基础资料。

κ-卡拉胶对马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白稳定性的影响

【目的】探究Kappa-卡拉胶对马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白稳定性的影响,为进一步开发利用马氏珠母贝肉以及改善水产肌肉蛋白加工特性提供数据参考。【方法】以马氏珠母贝肌肉水溶性蛋白(WSP)为研究对象,采用浊度法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同pH值条件下,热处理前后kappa-卡拉胶对WSP稳定性的影响,同时利用凝胶过滤层析对WSP进行了初步的分离及分子质量分布分析。【结果】热处理前后,在酸性条件下(pH<4.0)添加了kappa-卡拉胶的胶体蛋白混合体系(K-WSP)透光率均下降;热处理前,pH4.0～5.0范围内,与WSP对照,K-WSP混合体系透光率上升,而pH> 5.0条件下,kappa-卡拉胶对WSP体系透光率无显著性影响;热处理后,pH 4.0～7.5范围内,与WSP对照,K-WSP混合体系透光率上升,而pH>8.0条件下,kappa-卡拉胶对WSP体系透光率无显著性影响。SDS-PAGE结果显示:热处理前,酸性pH条件下与未添加WSP相比较,K-WSP在35 ku附近条带较多。热处理后,WSP和K-WSP的大分子蛋白组分(200、116 ku)均基本发生了热变性。WSP分离纯化曲线显示出两个组分,分子质量分别分布于200～35 ku和35～14.4 ku。【结论】pH值4.0～5.0条件下,kappa-卡拉胶对WSP的热稳定性有一定促进作用。

马氏珠母贝贝壳基质蛋白基因Pm-PNU7的克隆和功能研究

【目的】研究马氏珠母贝(Pinctada martensii)贝壳基质蛋白(Shell Matrix Proteins, SMPs)基因(Pm-PNU7)表达与功能。【方法】利用马氏珠母贝基因组和蛋白质组信息分析和RACE技术克隆获得壳基质蛋白新基因Pm-PNU7全长序列,通过原位杂交对其进行定位,RNA干扰检测其对贝壳形成的影响。【结果】Pm-PNU7的cDNA全长为797 bp,编码145个氨基酸,具有特殊的"KGG"重复序列和富含天冬氨酸(Asp)序列"DDDDDDHDD"。qRT-PCR分析表明,Pm-PNU7基因在外套膜边缘区和套膜区显著高表达(P<0.05);ISH检测显示,Pm-PNU7主要定位于边缘区外褶外侧和内侧上皮细胞、中褶内侧上皮细胞以及套膜区外侧上皮细胞。RNA干扰后,Pm-PNU7在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调,贝壳棱柱层和珍珠层微观结构均出现不同程度的紊乱。【结论】Pm-PNU7参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。